Peranan Bakteri Azospirillum Sp. pada Oryza sativa Kaya Nitrogen Melalui Pendekatan Rekombinasi Gen

Peranan Bakteri Azospirillum Sp. pada Oryza sativa Kaya Nitrogen Melalui Pendekatan Rekombinasi Gen

Role Of Bacteria Azospirillum Sp. on Nitrogen-Rich Oryza sativa Through Gene Rekombinan Approach

Fatimatuz Zahroh

Moch. Agus Krisno Budiyanto

Progam Studi Pendidikan Biologi FKIP Universitas Muhammadiyah Malang

Jl. Tlogomas 246 Malang Telp 464318 psw 120

 

Abstract

Oryza sativa L. is one of the most important crops in civilization. Although it mainly refers to the type of crop cultivation, rice is also used to refer to several types of genera (genus) the same, which is commonly referred to as wild rice. In the supply of nitrogen needed to tie up nitrogen as a bacterial growth of rice plants.

Azospirillum sp is a nitrogen-fixing soil bekteri nonsimbiotik.Bakteri is living freely in the soil, either around or near denganperakaran. Can be used as a biofertilizer. Bacteria are able to tie up nitrogen nd also produces growth hormone, is also able to remodel bahanorganik in the soil, such as carbohydrates. Life associated denganperakaran rhizosphere of plants in the area. Azospirillum sp bersimbiosa not live with legume plants to form root nodules, but only the association around plant roots, especially from families Graminaceae such as Oryza sativa, Zea mays, and the like.

Through gene recombination approach can produce new plants with gene expression by bacteria Azospirillum sp of Oryza sativa.

 

Key words: Oryza sativa L., Azospirillum, gene recombination.

 

Abstrak

            Oryza sativa L. adalah salah satu tanaman budidaya terpenting dalam peradaban. Meskipun terutama mengacu pada jenis tanaman budidaya, padi juga digunakan untuk mengacu pada beberapa jenis dari marga (genus) yang sama, yang biasa disebut sebagai padi liar. Dalam mensuplai kadar nitrogen diperlukan bakteri untuk menambat nitrogen sebagai pertumbuhan tanaman padi.

Azospirillum sp merupakan bekteri tanah penambat nitrogen nonsimbiotik.Bakteri ini hidup bebas di dalam tanah, baik di sekitar maupun dekat denganperakaran. Bisa digunakan sebagai biofertilizer. Bakteri tersebut mampu menambat nitrogen dn juga menghasilkan hormon pertumbuhan, juga mampu merombak bahanorganik di dalam tanah, misalnya karbohidrat. Hidup berasosiasi denganperakaran tanaman di daerah rizosfer. Azospirillum sp tidak hidup bersimbiosa dengan membentuk bintil akar tanaman legum, namun hanya berasosiasi di sekitar perakaran tanaman khususnya dari famili Graminaceae seperti Oryza sativa, Zea mays, dan sejenisnya.

            Melalui pendekatan rekombinasi gen dapat dihasilkan tanaman dengan ekspresi gen baru yang dilakukan oleh bakteri Azospirillum sp terhadap Oryza sativa.

 

Key words : Oryza sativa L, Azospirillum, rekombinasi gen.

PENDAHULUAN

 

            Pertanian pada Oryza sativa sangat tergantung dengan ketersediaan N dalam tanah. Sepanjang periode pertumbuhan tanaman memerlukan unsur N, namun yang paling banyak diperlukan antara awal pembentukan malai. Suplai N selama masa proses pemasakan diperlukan untuk menunda gugurnya daun, memelihara fotosintesis selama pengisian biji dan meningkatkan kadar protein dalam biji (Dobermann and Fairhust, 2000). 

            Kebutuhan N Oryza sativa di sawah dapat dipenuhi dari N yang berasal dari tanah, pupuk, dan air irigasi. Dari pupuk urea yang diberikan pada oryza sativa yang beririgasi ternyata hanya 29-45% yang ditemukan kembali pada tanaman.  Dan lebih dari 50-70-% Pupuk N yang diberikan hilang karena pencucian dan aliran permukaan, denitrifikasi dan volatilisasi amonia yang berpotensi memproduksi gas NO2, dan fiksasi oleh mineral sehingga tidak dapat dimanfaatkan oleh tanaman (Stoltzfus et al, 1997). Hal ini menunjukkan efisiensi penggunaan pupuk N.

            Salah satu Pendekatan untuk mengatasi kehilangan N sebagai penghematan dalam pemakaian pupuk anorganik, yakni meningkatkan efisiensi penggunaan N tersedia dalam tanah melalui penambatan N2 (Reddy, et al. 1997). Pemanfaatan bakteri penambat N melalui teknologi rekombinan DNA mam-

pu meningkatkan efisiensi pemupukan N.

            Dalam upaya mencapai tujuan akhir strategi jangka panjang, penggunaan bakteri penambat N2 berpotensi meningkat

kan produksi dan pendapatan usaha tani padi. Penambatan N pada lahan sawah seperti dipublikasikan sebelum tahun 1980, rata-rata 27 kg haˉ¹. Menurut Quispel (1974), jumlah total N yang ditambat ada lahan sawah sedunia dapat mencapai 4 juta t tahunˉ¹, yang mana 30 kg N haˉ¹ adalah hasil penambatan N2 yang kurang lebih setara dengan 11%dari pupuk N yang diaplikasikan setiap tahunnya pada semua jenis tanaman di dunia pada saat itu. Berdasarkan analisis N pada permukaan tanah, penambatan N2 dalam lahan sawah mencapai 23-35 kg N haˉ¹ tahunˉ¹ (Ono and Koga, 1984). Sedangkan menurut Ito (1977), berdasarkan studi keseimbangan N selama lebih dari 70 tahun diperoleh rata-rata pengkayaan N pada permukaan tanah 38,5 kg N haˉ¹ tahunˉ¹ pada plot tanpa pemupukan, dan 39,6 kg haˉ¹ tahunˉ¹ pada plot yang di kapur.

            Tanaman transgenik adalah tanaman yang telah disisipi atau memiliki gen asing dari spesies tanaman yang berbeda atau makhluk hidup lainnya. Penggabungan gen asing ini bertujuan untuk mendapatkan tanaman dengan sifat-sifat yang diinginkan, misalnya pembuatan tanaman yang tahan suhu tinggi, suhu rendah, kekeringan, resisten terhadap organisme pengganggu tanaman, serta kuantitas dan kualitas yang lebih tinggi dari tanaman alami. Sebagian besar rekayasa atau modifikasi sifat tanaman dilakukan untuk mengatasi kebutuhan pangan penduduk dunia yang semakin meningkat dan juga permasalahan kekurangan gizi manusia sehingga pembuatan tanaman transgenik juga menjadi bagian dari pemuliaan tanaman, (Anonymous, 2011).

Oryza sativa merupakan tanaman yang dapat dijadikan sebagai tanaman transgenik sebagai efisiensi peningkatan penambatan N melalui rekayasa genetika.

Rekayasa genetika adalah proses mengidentifikasi dan mengisolasi DNA dari suatu sel hidup atau mati dan memasukkannya dalam sel hidup lainnya. Rekayasa genetika merupakan suatu cara memanipulasikan gen untuk menghasilkan makhluk hidup baru dengan sifat yang diinginkan. Rekayasa genetika disebut juga pencangkokan gen atau rekombinasi DNA. Proses tersebut melalui beberapa tahap diantarany adalah Transfer gen, yang dapat dilakukan dengan beberapa metode, yaitu metode senjata gen, metode  transformasi DNA dan elektroporasi   (transfer DNA dengan bantuan listrik). Pada proses pembuatan tanaman  transgenik pada Oryza sativa menggunakan metode transformasi DNA (Anonymous, 2011)

 

PEMBAHASAN

Nitrogen merupakan hara mineral esensil paling banyak dimanfaatkan dalam praktek pertanian yang diberikan dalam bentuk pupuk. Nitrogen merupakan unsure penyusun asam amino, protein, asam nukleat dan sebagainya disamping unsur hara  lainnya.

Nitrogen yang dapat di manfaatkan oleh tanaman tinggkat tingggi khususnya tanaman budidaya dapat di bedakan atas empat kelompok utama yaitu: nitrogen nitrat (NO3), nitrogen ammonia (NH4+), nitrogen molekuler (N2) dan nitrogen organic. Tidak semua bentuk – bentuk ini dapat dimanfaatkan oleh suatu jenis tnaman. Umumnya tanaman pertanian memanfaatkan nitrat dan ammonium kecuali pada beberapa tanaman legume mampu memanfaatkan N bebas melalui proses fiksasi N dengan bersimbiosis dengan bakteri. N organik kadang – kadang dapat dimanfaatkan oleh tanaman tinggi akan tetapi tidak mampu mencukupi kebutuahan N tanaman dan umumnya dimanfaatkan lewat daun melalui pemupukan lewat daun. Bagi tanaman pertanian terutama manfaat N dalam bentuk ion nitra, akan tetapi dalam kondisi tertentu khususnya pada tanah – tanah masam  dan kondisi anaerobik tanaman akan memanfaatkan N dalam bentuk ion ammonium (NH4+).

                Bakteri penambat N2 bersifat aerob dan anaerob fakultatif, heterotrof dan fototrof pada tanah sawah turut berkontribusi terhadap kesediaan N bagi tanaman. Bakteri heterotrof dominan pada zona perakaran. Bakteri penambat N2 di daerah perakaran dan bagian dalam jaringan tanaman padi, yaitu Pseudomonas sp, Enterobacteriaceae, Bacillus, Azotobacter, Azospirillum dan Herbaspirillum telah terbukti mampu me-

ningkatkan secara nyata penambatan N2 (James and Olivares, 1997).

            Ditinjau dari aspek ekologi, bakteri penambat N2 yang mengkolonisasi tanaman Gramineae (rumput-rumputan) dapat dikelompokkan menjadi tiga golongan yaitu bakteri rizosfer penambat N2 (diazotrof) (heterotrofik dan fototrofik), bakteri diazotrof endofitik fakultatif, dan bakteri diazotrof endofitik obligat (Anonymous, 2011).

            Berbagai manfaat yang dapat dieroleh dari penggunaan mikroba yaitu menyediakan sumber hara tanaman, melindungi akar dari gangguan hama dan penyakit, menstimulir sistem perakaran agar berkembang sempurna, memperpanja-

ng usia akar, memacu mitosis jaringan meristem pada titik tumbuh pucuk kuncup bunga dan stolon, sebagai penawar racun beberapa logam berat, sebagai metabolit pengatur tumbuh dan sebagai bioaktivator perombak bahan organik sehingga disebut sebagai bioregulator (pengatur biologis) tanah, (Anonymous, 2011).

Azospirillum sp selain mampu menambat nitrogen dan menghasilkan hormon pertumbuhan, juga mampu merombak bahan organik di dalam tanah. Bahan organik yang dimaksud adalah bahan organik yang berasal dari kelompok karbohidrat, seperti selulosa, amilosa, dan bahan organik yang mengandung sejumlah lemak dan protein (Anonymous, 2012). Hal ini sesuai dengan QS. An-Nahl:13

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Maksud dari ayat di atas yaitu Alloh telah menciptakan berbagai macam makhluk hidup di bumi ini mulai dari yang bisa dilihat dengan mata sampai yang kasat mata. Itu merupakan tanda-tanda kekuasaan Allah. Misalnya pada bakteri Azosprillum sp  yang merupakan makhluk hidup mikroskopis yang diciptakan oleh Allah yang dapat kita pelajari dalam ilmu rekayasa genetika.

 

Prinsip Dasar Rekayasa Genetika

Rekayasa genetika adalah proses mengidentifikasi dan mengisolasi DNA dari suatu sel hidup atau mati dan memasukkannya dalam sel hidup lainnya. Rekayasa genetika merupakan suatu cara memanipulasikan gen untuk menghasilkan makhluk hidup baru dengan sifat yang diinginkan. Rekayasa genetika disebut juga pencangkokan gen atau rekombinasi DNA.

Dalam rekayasa genetika digunakan DNA untuk menggabungkan sifat makhluk hidup. Hal itu karena DNA dari setiap makhluk hidup mempunyai struktur yang sama, sehingga dapat direkombinasikan. Selanjutnya DNA tersebut akan mengatur sifat-sifat makhluk hidup secara turun-temurun.

Rekayasa Genetika pada mikroba bertujuan untuk meningkatkan efektivitas kerja mikroba tersebut (misalnya mikroba untuk fermentasi, pengikat nitrogen udara, meningkatkan kesuburan tanah, mempercepat proses kompos dan pembuatan makanan ternak, mikroba prebiotik untuk makanan olahan), dan untuk menghasilkan bahan obat-obatan dan kosmetika, serta pembuatan insulin manusia dari bakteri (Sel pankreas yang mampu mensekresi Insulin digunting,  potongan DNA itu disisipkan ke dalam Plasmid bakteri) DNA rekombinan yang terbentuk menyatu dengan Plasmid diinjeksikan lagi ke vektor, jika hidup segera dikembangbiakkan.

Prinsip dasar teknologi rekayasa genetika adalah memanipulasi atau melakukan perubahan susunan asam nukleat dari DNA (gen) atau menyelipkan gen baru ke dalam struktur DNA organisme penerima. Gen yang diselipkan dan organisme penerima dapat berasal dari organisme apa saja, (Anonymous,2010).

 

Proses Rekayasa Genetika

Pada proses penyisipan gen diperlukan tiga faktor utama yaitu

  1. Vektor, yaitu pembawa gen asing yang akan disisipkan, biasanya berupa plasmid, yaitu lingkaran kecil AND yang terdapat pada bakteri. Plasmid diambil dari bakteri dan disisipi dengan gen asing.
  2. Bakteri, berperan dalam memperbanyak plasmid. Plasmid di dalam tubuh bakteri akan mengalami replikasi atau memperbanyak diri, makin banyak plasmid yang direplikasi makin banyak pula gen asing yang dicopy sehingga terjadi cloning gen.

3. Enzim, berperan untuk memotong dan menyambung plasmid. Enzim ini disebut enzim endonuklease retriksi, enzim endonuklease retriksi yaitu enzim endonuklease yang dapat memotong ADN pada posisi dengan urutan basa nitrogen tertentu.

 

 

 

 

 

 
   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Gambar 1 : Kromosom Oryza satriva, (http://www.shigen.nig.ac.jp/rice/rgn/vol11/v11p182.gif)

 

 
   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Gambar 2 : Azospirillum, sp (http://www.biw.kuleuven.be/dtp/cmpg/ai_images/azospirillum.gif).

 

Prosedur Rekayasa Genetika Dengan Menggunakan Mikroorganisme Adalah Sebagai Berikut.

  1. Pemurnian DNA/Isolasi gen dengan menghancurkan atau melisiskan semua sel yang mengandung gen yang ditargetkan, kemudian dipisahkan dengan sentrifuge pada kecepatan tinggi dan ditambahkan bahan kimia sehingga didapatkan DNA murni. Ada tiga macam sumber DNA yang dapat diisolasi, yaitu sebagai berikut.
  2. DNA dapat berasal dari total genom organisme yang diinginkan
  3. DNA yang dibuat dari mRNA yang diisolasi dari jaringan tertentu. DNA ini dapat dibuat dari mRNA dengan menggunakan enzim reserve transcriptase.
  4. DNA dibuat secara invitro dari nukleotida dan enzim polimerase DNA.
  1. Pemecahan DNA : molekul DNA yang besar dipecah dengan menggunakan gelombang ultrasonic, maka akan dijumpai fragmen random. Dengan menggunakan enzim khusus bagi fragmen DNA seperti endonuklease restriksi akan diperoleh DNA  intermolekuler dan  intramolekuler atau hanya akan didapatkan urutan fragmen DNA dengan urutan tertentu. Supaya lebih stabil dikaitkan dengan enzim yang disebut T-4 DNA ligase. Contoh endonuklease restriksi adalah Hind II, Bam H1 dan Eco RI.
  2. Pemindahan gen/transfer DNA pada sel vector yang sesuai:transfer DNA ke bakteri yang hidup (cloning vector : plasmid, bakteriofage atau kosmid) dapat dengan cara, DNA asing dipaksakan berintegrasi dengan kromosom menjadi genom. Atau dengan cara gen asing dapat dikembangkan menjadi suatu bagian yang outonom molekul DNA yang sedang berkembang. Molekul DNA disebut sebagai vector. Penyambungan ini mengguna- kan enzim ligase.
    1. Memasukkan DNA rekombinan

       ke dalam sel inang. Sel inang yang dipakai harus seaman mungkin dan tidak bersifat patologis. Cara memasukkan DNA rekombinan kedalam sel inang dapat dilakukan dengan cara transformasi, transfeksi, DNA packaging dan micro injection.

  1. Identifikasi dan seleksi DNA yang baru diperoleh dari cirri klon rekombinan. Untuk menyeleksi DNA baru hasil rekombinan agar sesuai dengan yang diinginkan dapat dilakukan dengan tiga cara, yaitu cara genetik, hibridasi asam nukleat dan immunokimia (Anonymous, 2008)

 

Proses Teknologi Rekombinan Pada Oryza Sativa Kaya Nitrogen

     
   
 
   
 
   
 
   
 
   

Pengisolasian vektor dan DNA sumber gen

 

 

 

 

 

 

 

Penyisipan DNA ke dalam vektor

 

 

 

 

 

Pemasukan vektor pengklon ke dalam sel Azospirillum

 

 

 

 

 

 

 

Pengklonan vektor dan gen-gen asing

 

 

 

 

 

 

Identifikasi klon yang membawa gen yang diinginkan

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Oryza sativa kaya nitrogen

 

 

 

 

 

 

 

 

Skema proses rekombinasi gen

 

 

 
   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Gambar 3 : Contoh proses rekombinasi DNA (https://aguskrisnoblog.wordpress.com)

 

Dampak Positif dari Tanaman Transgenik

 

  1. Rekayasa transgenik dapat menghasilkan prodik lebih banyak dari sumber yang lebih sedikit.
  2. Rekayasa tanaman dapat hidup dalam kondisi lingkungan ekstrem akan memperluas daerah pertanian dan mengurangi bahaya kelaparan.
  3. Makanan dapat direkayasa supaya lebih lezat dan menyehatkan.

 

Dampak Negatif dari Tanaman Transgenik

 

A. Aspek sosial

1. Aspek ekonomi

Berbagai komoditas pertanian hasil rekayasa genetika telah memberikan ancaman persaingan serius terhadap komoditas serupa yang dihasilkan secara konvensional. Penggunaan tebu transgenik mampu menghasilkan gula dengan derajad kemanisan jauh lebih tinggi daripada gula dari tebu atau bit biasa (Anonymous, 2011).

 

B. Aspek kesehatan

1. Potensi toksisitas bahan pangan

Dengan terjadinya transfer genetik di dalam tubuh organisme transgenik akan muncul bahan kimia baru yang berpotensi menimbulkan pengaruh toksisitas pada bahan pangan. Sebagai contoh, transfer gen tertentu dari ikan ke dalam tomat, yang tidak pernah berlangsung secara alami, berpotensi menimbulkan risiko toksisitas yang membahayakan kesehatan.

2. Potensi menimbulkan penyakit

WHO pada tahun 1996 menyatakan bahwa munculnya berbagai jenis bahan kimia baru, baik yang terdapat di dalam organisme transgenik maupun produknya, berpotensi menimbulkan penyakit baru atau pun menjadi faktor pemicu bagi penyakit lain. Sebagai contoh, gen aad yang terdapat di dalam kapas transgenik dapat berpindah ke bakteri penyebab kencing nanah (GO), Neisseria gonorrhoeae.

 

C. Aspek lingkungan

1. Potensi erosi plasma nutfah

Penggunaan tembakau transgenik telah memupus kebanggaan Indonesia akan tembakau Deli yang telah ditanam sejak tahun 1864. Tidak hanya plasma nutfah tanaman, plasma nutfah hewan pun mengalami ancaman erosi serupa. Sebagai contoh, dikembangkannya tanaman transgenik yang mempunyai gen dengan efek pestisida, misalnya jagung Bt, ternyata dapat menyebabkan kematian larva spesies kupu-kupu raja (Danaus plexippus) sehingga dikhawatirkan akan menimbulkan gangguan keseimbangan ekosistem akibat musnahnya plasma nutfah kupu-kupu tersebut.

2. Potensi pergeseran gen

Daun tanaman tomat transgenik yang resisten terhadap serangga Lepidoptera setelah 10 tahun ternyata mempunyai akar yang dapat mematikan mikroorganisme dan organisme tanah, misalnya cacing tanah.

3. Potensi pergeseran ekologi

Organisme transgenik dapat pula mengalami pergeseran ekologi. Organisme yang pada mulanya tidak tahan terhadap suhu tinggi, asam atau garam, serta tidak dapat memecah selulosa atau lignin, setelah direkayasa berubah menjadi tahan terhadap faktor-faktor lingkungan tersebut (Anonymous,2011)

 

KESIMPULAN

1. Pembuatan Oryza sativa kaya nitrogen merupakan hasil tanaman transgenik melalui pendekatan rekombinasi DNAdengan metode transformasi gen..

2. Pada proses penyisipan gen diperlukan tiga faktor utama yaitu vektor, bakteri, dan enzim

3. Prosedur Rekayasa Genetika Dengan Menggunakan Mikroorganisme adalah Pemurnian DNA/Isolasi gen, DNA dapat berasal dari total genom organisme yang diinginkan, DNA yang dibuat dari mRNA yang diisolasi dari jaringan tertentu, DNA dibuat secara invitro dari nukleotida dan enzim polimerase DNA.

4. Tanaman transgenik memiliki dampak positif dan dampak negatif

 

 

 

 

 

 

 

 

DAFTAR PUSTAKA

 

Dobermann, A and P.F, White. 1999. Strategies for Nutrient Management in irrigated and rainfed lowland rice system. Nutr.Cycl. Agroecosyt. 53:1-18

Ito, J. 1977, Behavior and fixation of nitrogen in paddy field. Niigata Agronomy. 13:51-61 (In Japanese).

James E, F.L. Olivares, 1997. Infection and Colonization of sugar cane and other Graminaceous plants by endophytic diazrophicus. Plant science 17: 77-119.

Ladha J.K and P.M Reddy . 1995. Extension of Nitrogen Fixation to rice Nesessity an possibilities. Geojurnal 35: 363-372

Ono, S. And H. Koga. 1984. Natural nitrogen accumulation in paddy soil in relation to nitrogen fixation by blue-green algae,jpn. Jurnal science soil and Plant Nutrition 55: 465-470 (In Japanese).

Quispel, A. 1974. General  Introduction . PP 1-8 In the Biology of Nitrogen fixation, North-Holland Res. Monographs. Vol 33. (Cited from Kawaguchi, K (Ed.) 1978. Paddy Soil science. Kodansha, Tokyo. In Japanese).

Anonymous, 2011. Tanaman transgenik. ONLINE.http://id.wikipedia.org/wiki/Tanaman_transgenik. (Diakses 08 Januari 2012).

 Anonymous, 2011. Peran nitrogen terhadap tanaman . ONLINE. http://worldplant.multiply.com/journal/item/13/Peranan_Nitrogen_terhadap_Tanaman?&show_interstitial=1&u=%2Fjournal%2Fitem. (Diakses 08 Januari 2012)

Anonymous, 2011. Teknologi Pupuk Mikroba Untuk Meningkjatkan Efisiensi Pemupukan Dan Keberlanjutan Sistem Produksi Padi Sawah. Online. Http://Balittanah.Litbang.Deptan.Go.Id/Dokumentasi/Buku/Tanahsawah/Tanahsawah6.Pdf. (Diakses 08 Januari 2012).

Anonymous, 2011. Pengkajian Mikroba Potensial dan Aplikasinya pada tanaman hasil …ONLINE.

elib.pdii.lipi.go.id/katalog/index.php/searchkatalog/…/7435.pdf. (Diakses 08 Januari 2012)

Anonymous, 2011. Gambar proses rekombinasi DNA . ONLINE.https://aguskrisnoblog.wordpress.com. (Diakses 09 Januari 2012)

Anonymous, 2012. Azospirillum. ONLINE.http://www.scribd.com/doc/50922655/Azospirillum (Diakses 05 Januari 2012).

Anonymous, 2011. Rekayasa Genetika Bakteri Bacillus thuringiensis dalam Perakitan Tanaman Transgenik Tahan Hama. ONLINE.

https://aguskrisnoblog.wordpress.com. (Diakses 09 Januari 2012).

 

 

Advertisements

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s

%d bloggers like this: