REKAYASA GENETIKA – TRANSORMASI DNA

APLIKASI TEKNOLOGI TRANSFORMASI DNA BAKTERI Agrobacterium tumefaciens GALUR CP4 PADA TANAMAN KEDELAI UPAYA PENINGKATAN KULTIVAR RESISTEN TERHADAP HERBISIDA


DNA Bacterial Transformation Technology Applications Agrobacterium tumefaciens strain CP4 on Soybean Crop Improvement Efforts cultivars resistant to herbicides

Amalia Rakhman (0930047), DR. Moch. Agus Krisno Budiyanto, M.Kes
Program Studi Pendidikan Biologi FKIP Universitas Muhammadiyah Malang
Jl. Tlogomas 246 Malang Telp 464318

Abstract
Recombinant DNA technology or genetic engineering is often called is a science that studies the formation of new combinations of genetic material by the insertion of the DNA molecule into a vector allowing the integration and propagation in a cell having other organisms that serve as host cells. DNA transfer or transfer of DNA into the bacteria can be in three ways, namely conjugation, transformation, and transduction. Transformation is a collection of DNA by bacteria from the environment around him. DNA around the bacteria (foreign DNA) can be either DNA fragments or DNA fragments derived from other bacterial cells or other organisms. One application is the formation of DNA transformation of soybean plants resistant to herbicides by inserting genes from herbicide resistant bacterium tumefaciens strain CP4 Agrobactrium. These bacteria can infect soybean plants naturally because it has a Ti plasmid, a vector (carrier DNA) to insert a foreign gene.

Key words: DNA Recombination, DNA transformation, Agrobacterium CP4, Soybean Plants

Abstrak
Teknologi DNA rekombinan atau sering disebut juga rekayasa genetika merupakan suatu ilmu yang mempelajari pembentukan kombinasi materi genetik yang baru dengan cara penyisipan molekul DNA ke dalam suatu vektor sehingga memungkinkannya terjadinya integrasi dan mengalami perbanyakan dalam suatu sel organisme lain yang berperan sebagai sel inang. Transfer DNA atau perpindahan DNA ke dalam bakteri dapat melalui tiga cara, yaitu konjugasi, transformasi, dan transduksi. Transformasi merupakan pengambilan DNA oleh bakteri dari lingkungan di sekelilingnya. DNA yang berada di sekitar bakteri (DNA asing) dapat berupa potongan DNA atau fragmen DNA yang berasal dari sel bakteri yang lain atau organisme yang lain. Salah satu aplikasi transformasi DNA yaitu pembentukan tanaman kedelai resisten terhadap herbisida dengan memasukan gen resisten herbisida dari bakteri Agrobactrium tumefaciens galur CP4. Bakteri ini dapat menginfeksi tanaman kedelai secara alami karena memiliki plasmid Ti, suatu vektor (pembawa DNA) untuk menyisipkan gen asing.

PENDAHULUAN
Bioteknologi merupakan cabang ilmu yang mempelajari pemanfaatan makhluk hidup (bakteri, fungi, virus, dan lain-lain) maupun produk dari makhluk hidup (enzim, alkohol) dalam proses produksi untuk menghasilkan barang dan jasa. Perkembangan bioteknologi tidak hanya didasari pada biologi semata, tetapi juga pada ilmu-ilmu terapan dan murni lainnya, seperti biokimia, komputer, biologi molekular, mikrobiologi, genetika, kimia ,matematika, dan lain sebagainya (Listanto, 2011).
Pada masa ini, perkembangan bioteknologi sudah sangat pesat, terutama di negara-negara maju. Penerapan bioteknologi dimasa ini misalnya di bidang pangan, dengan menggunakan teknologi rekayasa genetika, kultur jaringan dan rekombinan DNA, dapat dihasilkan tanaman dengan sifat dan produk unggul karena mengandung zat gizi yang lebih jika dibandingkan tanaman biasa, serta juga lebih tahan terhadap hama maupun tekanan lingkungan.
Teknik DNA rekombinan adalah rekayasa genetika untuk menghasilkan sifat baru dengan cara merekombinasikan gen tertentu dengan DNA genom. Manfaat rekayasa genetika ini diantaranya adalah dimungkinkannya melakukan isolasi dan mempelajari fungsi masing-¬masing gen dan mekanisme kontrolnya. Selain itu, rekayasa genetika juga memungkinkan diperolehnya suatu produk dengan sifat tertentu dalam waktu lebih cepat dan jumlah lebih besar daripada produksi secara konvensional. Adapun Teknik Rekombinan DNA diantaranya isolasi DNA, teknik memotong DNA, teknik menggabung DNA dan teknik untuk memasukan DNA ke dalam sel hidup.
Transfer DNA atau perpindahan DNA atau perpindahan DNA ke dalam bakteri dapat melalui tiga cara, yaitu konjugasi, transformasi, dan transduksi. DNA yang masuk ke dalam sel bakteri selanjutnya dapat berintegrasi dengan DNA atau kromosom bakteri sehingga terbentuk kromosom rekombinan. Konjugasi merupakan perpindahan DNA dari satu sel (sel donor) ke dalam sel bakteri lainnya (sel resepien) melalui kontak fisik antara kedua sel. Transformasi merupakan pengambilan DNA oleh bakteri dari lingkungan di sekelilingnya. Sedangkan Transduksi adalah cara pemindahan DNA dari satu sel ke dalam sel lainnya melalui perantaraan bakteriofage.
Aplikasi teknik DNA rekombinan dalam bioteknologi diantaranya adalah pembuatan tanaman transgenik. Tanaman transgenik merupakan tanaman yang telah disisipi atau memiliki gen asing dari spesies tanaman yang berbeda atau makhluk hidup lainnya. Penggabungan gen asing ini bertujuan untuk mendapatkan tanaman dengan sifat-sifat yang diinginkan, misalnya pembuatan tanaman yang tahan suhu tinggi, suhu rendah, kekeringan, resisten terhadap organisme pengganggu tanaman, serta kuantitas dan kualitas yang lebih tinggi dari tanaman alami.
Beberapa tanaman transgenik telah diaplikasikan untuk menghasilkan tiga macam sifat unggul, yaitu tahan hama, tahan herbisida, dan buah yang dihasilkan tidak mudah busuk. Misalnya Tanaman jagung dan kapas transgenik dengan sifat tahan hama telah diproduksi secara massal dan dipasarkan di dunia. Gen asing yang banyak digunakan untuk sifat resistensi hama ini adalah gen penyandi toksin Bt dari bakteri Bacillus thuringiensis.
Tanaman kedelai merupakan salah satu tanaman pangan penting di Indonesia setelah padi dan jagung, yang hingga saat ini masih perlu diimpor. Kebutuhan kedelai Indonesia terus meningkat sebesar 2.24 juta ton setiap tahunnya, padahal kapasitas produksi kedelainasional hanya mencapai 1.19 juta tondari luas areal tanam 967.002 ha (Badan Pusat Statistik, 2002).
Kendala dalam peningkatan produksi tanaman kedelai adalah tingginya serangan penyakit dan hama tanaman, terutama hama penggerek polong kedelai yang disebabkan oleh Etiella zinkenella dari ordo Lepidoptera. Hama ini merupakan hama penting tanaman kedelai yang hingga saat ini masih sulit untuk diatasi, karena sifat penyerangnya yang sulit dideteksi secara cepat dari luar.
Dari latar belakang diatas maka pada penulisan artikel kali ini, akan dibahas mengenai bagaimana aplikasi teknologi transformasi DNA bakteri Agrobacterium galur CP4 resisten terhadap herbisida pada tanaman kedelai.

PEMBAHASAN
Transgenik adalah suatu organisme yang mengandung transgen melalui proses bioteknologi (bukan proses pemuliaan tanaman). Transgen adalah gen asing yang ditambahkan kepada suatu spesies. Suatu jasad yang memiliki sifat baru, yang sebelumnyatidak dimiliki oleh jenis jasad tersebut, sebagai hasil penambahan gen yang berasal dari jasadlain. Juga disebut organisme transgenik.
Teknik bioteknologi tanaman telah dimanfaatkan terutama untuk memberikan karakter baru pada berbagai jenis tanaman. Teknologi rekayasa genetika tanaman memungkinkan pengintegrasian gen-gen yang berasal dari organisme lain untuk perbaikan sifat tanaman. Salah satu contoh aplikasi bioteknologi dibidang pertanian adalah mengembangkan tanaman transgenic yang memiliki sifat toleran terhadap zat kimia tertentu (tahan herbisida), tahan terhadap hama dan penyakit, serta mempunyai sifat-sifat khusus (misalnya tomat yang matangnya lama, padi yang memproduksi beta-caroten dan vitamin A).
Tanaman transgenic diperoleh dari hasil rekayasa genetika dengan teknologi DNA rekombinan. Teknologi DNA rekombinan atau sering disebut juga rekayasa genetika ini adalah suatu ilmu yang mempelajari tentang pembentukan kombinasi materi genetik yang baru dengan cara penyisipan molekul DNA ke dalam suatu vektor sehingga memungkinkannya terjadinya integrasi dan mengalami perbanyakan dalam suatu sel organisme lain yang berperan sebagai sel inang. Manfaat rekayasa genetika ini diantaranya adalah dimungkinkannya melakukan isolasi dan mempelajari fungsi masing¬masing gen dan mekanisme kontrolnya. Selain itu, rekayasa genetika juga memungkinkan diperolehnya suatu produk dengan sifat tertentu dalam waktu lebih cepat dan jumlah lebih besar daripada produksi secara konvensional.
Teknik DNA rekombinan merupakan kumpulan teknik untuk merekombinasi gen dalam tabung reaksi. Teknik itu diantaranya isolasi DNA, teknik memotong DNA, teknik menggbung DNA dan teknik untuk memasukan DNA ke dalam sel hidup. Setelah DNA rekombinan terbentuk maka dilakukan proses transformasi ke host cell kemudian dilkakukan proses inkubasi sel bakteri tersebut. Setelah dilakukan inkubasi maka sel bakteri dapat diuji kehadiran DNA rekombinannya yaitu melalui uji antibiotik, uji medium seleksi dan seleksi putih biru. Setelah didapatkan bakteri dengan DNA rekombinan maka dilakukan purifikasi untuk mengisolasi gen yang direplikasi.
Transfer DNA atau perpindahan DNA atau perpindahan DNA ke dalam bakteri dapat melalui tiga cara, yaitu konjugasi, transformasi, dan transduksi. DNA yang masuk ke dalam sel bakteri selanjutnya dapat berintegrasi dengan DNA atau kromosom bakteri sehingga terbentuk kromosom rekombinan. Pada pembuatan kedelai transgenik resisten terhadap herbisida digunakan transfer DNA dengan cara transformasi genetic. Transformasi merupakan pengambilan DNA oleh bakteri dari lingkungan di sekelilingnya. DNA yang berada di sekitar bakteri (DNA asing) dapat berupa potongan DNA atau fragmen DNA yang berasal dari sel bakteri yang lain atau organisme yang lain. Masuknya DNA dari lingkungan ke dalam sel bakteri ini dapat terjadi secara alami.

Gambar 1 : Proses Transformasi

Gambar 2 : Proses transformasi pada sel bakteri

Perangkat teknologi DNA rekombinan
Adapun perangkat yang digunakan dalam teknik DNA rekombinan diantaranya enzim restriksi untuk memotong DNA, enzim ligase untuk menyambung DNA dan vektor untuk menyambung dan mengklonkan gen di dalam sel hidup, transposon sebagai alat untuk melakukan mutagenesis dan untuk menyisipkan penanda, pustaka genom untuk menyimpan gen atau fragmen DNA yang telah diklonkan, enzim transkripsi balik untuk membuat DNA berdasarkan RNA, pelacak DNA atau RNA untuk mendeteksi gen atau fragmen DNA yang diinginkan atau untuk mendeteksi klon yang benar. Vektor yang sering digunakan diantaranya plasmid, kosmid dan bakteriofag.

Gambar : Plasmid bakteri sebagai vektor

Enzim restriksi digunakan untuk memotong DNA. Enzim restriksi mengenal dan memotong DNA pada sekuens spesifik yang panjangnya empat sampai enam pasang basa. Enzim tersebut dikenal dengan nama enzim endonuklease restriksi.
Sesuai dengan firman Allah SWT yang tercantum di surat Al-furqon ayat 2, menjelaskan bahwa Allah menciptakan segala sesuatu dan menetapkan ukuran dengan serapi-rapinya. Hal itu dibuktikan dengan penciptaan plasmid pada bakteri Agrobacterium tumefuriens yang sangat khusus dan fungsional dan berfungsi dalam transformasi genetic.

Artinya : “yang kepunyaan-Nya-lah kerajaan langit dan bumi, dan Dia tidak mempunyai anak, dan tidak ada sekutu bagiNya dalam kekuasaan(Nya), dan dia telah menciptakan segala sesuatu, dan Dia menetapkan ukuran-ukurannya dengan serapi-rapinya (QS. Al-furqon: 2)

Isolasi DNA
Isolasi DNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel, yang dapat dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku¬leleh maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim. Langkah berikutnya adalah lisis sel. Bahan-¬bahan sel yang relatif lunak dapat dengan mudah diresuspensi di dalam medium bufer nonosmotik, sedangkan bahan¬bahan yang lebih kasar perlu diperlakukan dengan deterjen yang kuat seperti triton X¬ 100 atau dengan sodium dodesil sulfat (SDS).
Pada eukariot langkah ini harus disertai dengan perusakan membran nukleus. Setelah sel mengalami lisis, remukan¬remukan sel harus dibuang. Biasanya pembuangan remukan sel dilakukan dengan sentrifugasi. Protein yang tersisa dipresipitasi menggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform untuk kemudian disentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis dengan proteinase. DNA yang telah dibersihkan dari protein dan remukan sel masih tercampur dengan RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA. Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan
dengan penambahan amonium asetat dan alkohol atau dengan sentrifugasi kerapatan menggunakan CsCl.
Teknik isolasi DNA tersebut dapat diaplikasikan, baik untuk DNA genomik maupun DNA vektor, khususnya plasmid. Untuk memilih di antara kedua macam molekul DNA ini yang akan diisolasi dapat digunakan dua pendekatan. Pertama, plasmid pada umumnya berada dalam struktur tersier yang sangat kuat atau dikatakan mempunyai bentuk covalently closed circular (CCC), sedangkan DNA kromosom jauh lebih longgar ikatan kedua untainya dan mempunyai nisbah aksial yang sangat tinggi. Perbedaan tersebut menyebabkan DNA plasmid jauh lebih tahan terhadap denaturasi apabila dibandingkan dengan DNA kromosom. Oleh karena itu, aplikasi kondisi denaturasi akan dapat memisahkan DNA plasmid dengan DNA kromosom.
Enzim Restriksi
Selanjutnya adalah pemotongan DNA dengan menggunakan enzim restriksi endonuklease. Pemutusan ini dilakukan di dalam strain tertentu yang bertujuan untuk mencegah agar tidak merusak DNA. Selain itu strain tersebut juga mempunyai suatu sistem modifikasi yang menyebabkan pemutusan basa pada urutan tertentu yang merupakan recognition sites bagi enzim restriksi tersebut. Pemotongan DNA genomik dan DNA vektor dengan menggunakan enzim restriksi ini harus menghasilkan ujung–ujung potongan yang kompatibel dalam arti setiap fragmen DNAnya harus dapat disambungkan dengan DNA vektor yang sudah berbentuk linier.
Pada aplikasi transformasi gen bakteri Agrobacterium tumefaciens resisten terhadap herbisida pada tanaman kedelai, bakteri ini dapat menginfeksi tanaman kedelai secara alami karena memiliki plasmid Ti, suatu vektor (pembawa DNA) untuk menyisipkan gen asing. Di dalam plasmid Ti terdapat gen yang menyandikan sifat virulensi untuk menyebabkan penyakit tanaman tertentu. Gen asing yang ingin dimasukkan ke dalam tanaman dapat disisipkan di dalam plasmid Ti. Selanjutnya, A. tumefaciens secara langsung dapat memindahkan gen pada plasmid tersebut ke dalam genom (DNA) tanaman. Setelah DNA asing menyatu dengan DNA tanaman maka sifat-sifat yang diinginkan dapat diekspresikan tumbuhan kedelai resisten terhadap herbisida.

Ligasi molekul DNA
Pemotongan DNA genomik dan DNA vektor menggunakan enzim restriksi harus menghasilkan ujung¬ujung potongan yang kompatibel. Artinya, fragmen¬-fragmen DNA genomik nantinya harus dapat disambungkan (diligasi) dengan DNA vektor yang sudah berbentuk linier. Ada tiga cara yang dapat digunakan untuk meligasi fragmen-fragmen DNA secara in vitro. Pertama, ligasi menggunakan enzim DNA ligase dari bakteri. Kedua, ligasi menggunakan DNA ligase dari sel¬sel E. coli yang telah diinfeksi dengan bakteriofag T4 atau lazim disebut sebagai enzim T4 ligase. Jika cara yang pertama hanya dapat digunakan untuk meligasi ujung-¬ujung lengket, cara yang kedua dapat digunakan baik pada ujung lengket maupun pada ujung tumpul. Sementara itu, cara yang ketiga telah disinggung di atas, yaitu pemberian enzim deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik 3’.
Suhu optimum bagi aktivitas DNA ligase sebenarnya 37ºC. Akan tetapi, pada suhu ini ikatan hidrogen yang secara alami terbentuk di antara ujung-ujung lengket akan menjadi tidak stabil dan kerusakan akibat panas akan terjadi pada tempat ikatan tersebut. Oleh karena itu, ligasi biasanya dilakukan pada suhu antara 4 dan 15ºC dengan waktu inkubasi (reaksi) yang diperpanjang (sering kali hingga semalam). Pada reaksi ligasi antara fragmen¬fragmen DNA genomik dan DNA vektor, khususnya plasmid, dapat terjadi peristiwa religasi atau ligasi sendiri sehingga plasmid yang telah dilinierkan dengan enzim restriksi akan menjadi plasmid sirkuler kembali. Hal ini jelas akan menurunkan efisiensi ligasi. Untuk meningkatkan efisiensi ligasi dapat dilakukan beberapa cara, antara lain penggunaan DNA dengan konsentrasi tinggi (lebih dari 100Ng/ml), perlakuan dengan enzim alkalin fosfatase untuk menghilangkan gugus fosfat dari ujung 5’ pada molekul DNA yang telah terpotong, serta pemberian molekul linker, molekul adaptor, atau penambahan enzim deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik 3’ seperti telah disebutkan di atas.
Transformasi Sel Inang
Tahap berikutnya setelah ligasi adalah analisis terhadap hasil pemotongan DNA genomik dan DNA vektor serta analisis hasil ligasi molekul¬-molekul DNA tersebut. Tahap memasukkan campuran reaksi ligasi ke dalam sel inang ini dinamakan transformasi karena sel inang diharapkan akan mengalami perubahan sifat tertentu setelah dimasuki molekul DNA rekombinan. Teknik transformasi pertama kali dikembangkan pada tahun 1970 oleh M. Mandel dan A. Higa, yang melakukan transformasi bakteri E. coli. Sebelumnya, transformasi pada beberapa spesies bakteri lainnya yang mempunyai sistem transformasi alami seperti Bacillus subtilis telah dapat dilakukan. Kemampuan transformasi B. subtilis pada waktu itu telah dimanfaatkan untuk mengubah strain¬strain auksotrof (tidak dapat tumbuh pada medium minimal) menjadi prototrof (dapat tumbuh pada medium minimal) dengan menggunakan preparasi DNA genomik utuh. Baru beberapa waktu kemudian transformasi
dilakukan menggunakan perantara vektor, yang selanjutnya juga dikembangkan pada transformasi E.coli.
Seleksi Transforman dan Seleksi Rekombinan
Oleh karena DNA yang dimasukkan ke dalam sel inang bukan hanya DNA rekombinan, maka kita harus melakukan seleksi untuk memilih sel inang transforman yang membawa DNA rekombinan. Selanjutnya, di antara sel¬sel transforman yang membawa DNA rekombinan masih harus dilakukan seleksi untuk mendapatkan sel yang DNA rekombinannya membawa fragmen sisipan atau gen yang diinginkan. Pada dasarnya ada tiga kemungkinan yang dapat terjadi setelah transformasi dilakukan, yaitu (1) sel inang tidak dimasuki DNA apa pun atau berarti transformasi gagal, (2) sel inang dimasuki vektor religasi atau berarti ligasi gagal, dan (3) sel inang dimasuki vektor rekombinan dengan/tanpa fragmen sisipan atau gen yang diinginkan.
Untuk membedakan antara kemungkinan pertama dan kedua dilihat perubahan sifat yang terjadi pada sel inang. Jika sel inang memperlihatkan dua sifat marker vektor, maka dapat dipastikan bahwa kemungkinan kedualah yang terjadi. Selanjutnya, untuk membedakan antara kemungkinan kedua dan ketiga dilihat pula perubahan sifat yang terjadi pada sel inang. Jika sel inang hanya memperlihatkan salah satu sifat di antara kedua marker vektor, maka dapat dipastikan bahwa kemungkinan ketigalah yang terjadi. Seleksi sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan dilakukan dengan mencari fragmen tersebut menggunakan fragmen pelacak (probe), yang pembuatannya dilakukan secara in vitro menggunakan teknik reaksi polimerisasi berantai atau polymerase chain reaction (PCR).
Pelacakan fragmen yang diinginkan antara lain dapat dilakukan melalui cara yang dinamakan hibridisasi koloni. Koloni¬koloni sel rekombinan ditransfer ke membran nilon, dilisis agar isi selnya keluar, dibersihkan protein dan remukan sel lainnya hingga tinggal tersisa DNAnya saja. Selanjutnya, dilakukan fiksasi DNA dan perendaman di dalam larutan pelacak. Posisi¬posisi DNA yang terhibridisasi oleh fragmen pelacak dicocokkan dengan posisi koloni pada kultur awal (master plate). Dengan demikian, kita bisa menentukan koloni¬koloni sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan.
Skema Aplikasi Transformasi Gen Agrobacterium pada tanaman kedelai

KESIMPULAN
Teknik DNA rekombinan adalah rekayasa genetika untuk menghasilkan sifat baru dengan cara merekombinasikan gen tertentu dengan DNA genom. Teknik DNA rekombinan merupakan kumpulan teknik untuk merekombinasi gen dalam tabung reaksi. Teknik itu diantaranya isolasi DNA, teknik memotong DNA, teknik menggbung DNA dan teknik untuk memasukan DNA ke dalam sel hidup.
Pada aplikasi rekombinan DNA bakteri Agrobacterium tumefaciens terhadap tanaman kedelai menggunakan teknik transformasi gen. Dimana DNA bakteri resisten terhadap herbisida tersebut dipotong dan kemudian disambung dengan DNA sel dari tumbuhan kedelai kemudian diinjeksi ke tanaman kedelai.

DAFTAR PUSTAKA
Afifatun. 2008. Transformasi Plasmid DNA Metode Elektroporasi. http://afie.staff.uns.ac.id. Diakses tanggal Januari 2011

Aidya.2011. Ligasi dan Transformasi DNA. http://aidya73.wordpress. com. Diakses tanggal 4 Januari 2011

Anonymous.2010.Tanaman Transgenik. http://www.wikipedia.org. Diakses tgl 2 Januari 2011.

Bioscience.2010. Transformasi Ekspresi Gen Asing Dalam Sel Bakteri. http://sciencebiotech.net. Di Akses tanggal 4 Januari 2011.

Edi, Listanto. 2011. Sains dan Teknologi.http://listantoedy.wordpress.com. Diakses tanggal 2 Januari 2011

Haryono. 2008. Transformasi sel Inang DNA.http://www.artikelkimia.info. Diakses tanggal 4 Januari 2011

Advertisements

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s

%d bloggers like this: