Teknik Penyisipan Gen Kitinase pada  Kopi Robusta (Coffea canephora) yang Resisten Terhadap  Penyakit Busuk Akar melalui Agrobagterium tumefaciens LBA4404

Chitinase Gene Insertion Techniques in Robusta Coffee (Coffea canephora) are Resistant to Root Disease by Agrobagterium tumefaciens LBA4404

Heni Tri Utami, Dr .H. Moch. Agus Krisno B, M. Kes

Program Studi Pendidikan Biologi FKIP Universitas Muhammadiyah Malang

Jl. Tlogomas 246 Malang Telp 464318

Abstract

Genetic engineering of robusta coffee for resistance to pathogenic fungi is considered to be one of the potential approaches to overcome the problem at robusta coffee plantation caused by pathogenic fungi. This research was aimed to introduce chitinase (CHI) gene into embryogenic calli of robusta coffee and regenerate the plantlets. Embryogenic calli were co-cultivated with Agrobacterium tumefaciens LBA4404 harboring pCAMBIA1301 which contains chitinase gene under 35S promoter.

The result revealed that among the four AC concentrations tested, 100 mg/L gave the highest percentage of calli growing on the selection medium (42.5%). BAP concentration of 5 mg/L alone was the most effective for inducing of SE from transformed calli with the highest percentage of 43.1% and average number SE of 8.8 ± 3. The strongest medium containing 150 mg/L AC, which were 56.5% and 40% respectivelly. PCR analysis showed that 7 out of 12 plantlets tested, contained CHI gene. From this research 28 transgenic plantlets of robusta coffee were obtained.

Key word: Coffea canephora, Agrobacterium tumefaciens, chitinase gene

Abstrak

Rekayasa genetika untuk merakit tanaman kopi robusta tahan jamur pathogen dipandang merupakan salah satu pendekatan alternatif yang potensial untuk mengatasi masalah pada perkebunan kopi robusta akibat serangan jamur patogen. Penelitian ini bertujuan untuk meng-introduksikan gen kitinase (CHI) ke dalam kalus embriogenik kopi robusta dan regenerasinya menjadi planlet, sebagai upaya untuk merakit tanaman kopi robusta tahan serangan jamur. Kalus embriogenik diko-kultivasi dengan Agrobacterium tumefaciens LBA4404 pembawa pCAMBIA1301 yang mengandung gen kitinase di bawah kontrol promotor 35S.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa dari keempat konsentrasi AS yang diuji, AS 100 mg/L ternyata menghasilkan persentase tertinggi kalus yang tumbuh pada medium seleksi (42,5%). Konsentrasi BAP 5 mg/L tanpa penambahan IAA efektif menginduksi ES dari kalus hasil transformasi dengan persentase tertinggi 43,1% dan rata-rata jumlah ES 8,8±3. Ekspresi GUS tertinggi dideteksi pada kalus tiga hari setelah transformasi dan kalus yang tumbuh di medium seleksi yang mengandung AS 150 mg/L, masing-masing 56,5% dan 40,0 %. Analisis PCR menunjukkan bahwa 7 planlet dari 12 planlet yang diuji, membawa gen CHI. Dari penelitian ini dihasilkan 28 planlet kopi robusta transgenic.

PENDAHULUAN

Salah satu masalah utama dalam pengembangan tanaman kopi robusta adalah kepekaannya terhadap berbagai   jenis penyakit,  seperti penyakit busuk akar yang  disebabkan     oleh     jamur    Fomes lamoensis.  Serangan penyakit ini dilaporkan dapat menurunkan hasil sampai 70% (Sri-Sukamto & Junianto, 1997).

Upaya penanggulangan  penyakit tersebut secara kimiawi kurang  disukai karena selain biaya yang relative mahal, juga dapat meninggalkan residu yang dapat membahayakan konsumen. Perakitan tanaman kopi tahan terhadap serangan jamur patogen melalui rekayasa genetik dipandang merupakan salah satu pendekatan potensial untuk mengatasi masalah tersebut. Hal ini dapat ditempuh dengan caramengintroduksikan gen penyandi kitinase (CHI) ke dalam genom tanaman kopi.

Beberapa metode dapat digunakan  untuk memasukkan gen asing ke dalam genom tanaman. Cara yang paling murah  dan terbukti efektif untuk tanaman dikotil adalah transformasi menggunakan   bakteri  A.  tumefaciens (Hatanaka  et al, 1999).

Planlet kopi transgenik yang telah diperoleh,  dilaporkan mengekspresikan gen GUS, nptII  dan hptII  (Hatanaka et al, 1999), gen cryIAc untuk resistensi terhadap penyakit  leaf miner  (Leroy et al., 2002), gen untuk  resistensi terhadap herbisida (Sano &  Kusano, 2002) dan gen untuk kandungan  kafein yang lebih rendah (Ogita et al., 2002).

Untuk dapat mendeteksi terintegrasinya gen asing, umumnya digunakan gen penanda, misalnya gen GUS  yang  menyandikan   ß lurokonidase. Ekspresi gen penanda ini mudah diamati secara histokimia, karena reaksi yang dikatalisis oleh enzim tersebut menghasilkan produk berwarna biru. Gen GUS yang mengandung intron pada daerah  N terminal daricoding sequence sangat  disarankan penggunaannya Karena gus diekspresikan hanya pada sel tanaman, tidak pada sel bakteri (Hiei et al, 1997).

Gen Kitinase

Kitinase adalah enzim yang mempunyai kemampuan untuk  mendegradasi kitin, komponen  utama dinding sel jamur (Datta et al, 2000).

Di samping memiliki kemampuan menempel pada dinding sel jamur secara langsung, kitinase juga melepaskan oligo-N-asetil-glukosamin yang berfungsi sebagai elisitor, yang telah terbukti berperan penting dalam mengaktifkan respons ketahanan (Ren & West, 1992).

Agrobacterium tumefaciens

A.tumefaciens adalah bakteri patogen pada tanaman yang banyak digunakan untuk memasukkan gen asing ke dalam sel tanaman untuk menghasilkan suatu tanaman transgenik . Secara alami, A. tumefaciens dapat menginfeksi tanaman dikotiledon melalui bagian tanaman yang terluka sehingga menyebabkan tumor mahkota empedu (crown gall tumor) Bakteri yang tergolong ke dalam   gram negatifini memiliki sebuah plasmid  besar yang disebut plasmid-Ti  yang berisi gen penyandi faktor virulensi penyebab infeksi bakteri ini pada tanaman. Untuk memulai pembentukan tumor (Anonymous, 2011).

 

 

 

 

 

Gambar1.1 A. tumefaciens

Sumber: http://www.sciencephoto.com/media/13176/enlarge

Teknik Penyisipan Gen

Gen yang diinginkan (kitinase) dapat diambil dari tanaman lain, hewan, cendawan, atau bakteri.Setelah gen kitinase didapat, dilakukan perbanyakan gen yang disebut dengan istilah kloning gen. Pada tahapan kloning gen, DNA asing akan dimasukkan ke dalam vektor kloning (agen pembawa DNA), yaitu plasmid (DNA yang digunakan untuk transfer gen). Kemudian, vektor kloning akan dimasukkan ke dalam bakteri sehingga DNA dapat diperbanyak seiring dengan perkembangbiakan bakteri tersebut. Apabila gen yang diinginkan telah diperbanyak dalam jumlah yang cukup maka akan dilakukan transfer gen asing tersebut ke dalam sel tumbuhan yang berasal dari bagian tertentu, salah satunya adalah bagian daun. Transfer gen ini dapat dilakukan dengan metode transformasi yang diperantarai oleh Agrobacterium tumefaciens. Bakteri Agrobacterium tumefaciens dapat menginfeksi tanaman secara alami karena memiliki plasmid Ti, suatu vektor (pembawa DNA) untuk menyisipkan gen asing. Di dalam plasmid Ti terdapat gen yang menyandikan sifat virulensi untuk menyebabkan penyakit tanaman tertentu. Gen asing yang ingin dimasukkan ke dalam tanaman dapat disisipkan di dalam plasmid Ti. Selanjutnya, A. tumefaciens secara langsung dapat memindahkan gen pada plasmid tersebut ke dalam genom (DNA) tanaman. Setelah DNA asing menyatu dengan DNA tanaman maka sifat-sifat yang diinginkan dapat diekspresikan oleh  tumbuhan (Anonymous, 2011).

 

 

 

 

 

 

 

 

Gambar 1.2 perakitan tanaman transgenic

Sumber:http://biologigonz.blogspot.com/2011/12/transgenic-gen.html

Bahan Tanaman, vektor dan Galur Bakteri

Eksplan yang digunakan untuk transormasi adalah kalus embriogenik yang berasal dari eksplan daun kopi robusta klon BP308. Vektor untuk transformasi genetic yang digunakan adalah pCAMBIA1301 yang mengandung gen hptII dan gen gus dan telah disisipi gen  CHI. Sedangkan galur bakteri yang digunakan  adalah A. tumefaciens LBA4404 (Siswanto, et al. 2003).

Optimasi Medium Seleksi

Untuk   mendapatkan konsentrasi antibiotik higromisin yang tepat dalam menyeleksi tanaman kopi  transgenik, dilakukan uji efektivitas konsentrasi higromisin menggunakan eksplan kalus pada  medium ½ MS)  yang dilengkapi dengan vitamin B5  (Gamborg et al., 1968), 30 g/L sukrosa dan 2 mg/L gelrite. Konsentrasi higromisin yang  diuji adalah 0, 15, 25, 35, dan 45 mg/L. Pengamatan dilakukan terhadap jumlah   kalus   yang mati akibat pengaruh penambahan higromisin (Siswanto, et al. 2003).

Kultur A.  tumefaciens

            Agrobacterium tumefaciens yang mengandung pCAMBIA1301 ditumbuhkan pada medium  LB yang mengandung 50 mg/L kanamisin  dan 50 mg/L rifampisin dan  diinkubasi   semalam   pada incubator shaker berkecepatan 150 rpm dengan suhu 280C.  Setelah dilakukan pengenceran 1:3 dengan  medium LB, kultur diinkubasi kembali pada kondisi yang sama selama 3 jam. Kemudian  campuran disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 10 menit. Pelet bakteri  dipisahkan dari suspensi, kemudian dilarutkan dalam 20 mL medium ½ MS cair yang  mengandung 5 mg/L BAP dan 100 mg/L  asetosiringon. Campuran tersebut siap digunakan untuk transformasi (Siswanto, et al. 2003).

Transformasi dan  Regenerasi Planlet Transforman

Transformasi gen  CHI  ke dalam kalus embriogenik dilakukan mengikuti prosedur.

Sano & Kusano (2002) dengan beberapa modifikasi. Inokulasi dilakukan dengan  pengocokan eksplan bersama suspensi   A. tumefaciens pada kecepatan 60 rpm selama 30 menit. Setelah 3 hari kokultivasi pada medium ½ MS yang mengandung asetosiringon pada berbagai tingkat konsentrasi yang berbeda (0, 50, 100 dan 150 mg/L), eksplan dicuci tiga kali dengan  air steril, dilanjutkan dengan satu kali pencucian menggunakan larutan 300 mg/L  sefotaksim. Eksplan yang telah ditransformasi dipindahkan ke medium  seleksi yang mengandung 300 mg/L sefotaksim dan higromisin. Penggunaan  medium seleksi dilakukan secara bertingkat  yaitu medium seleksi  mengandung 5 mg/L  dan 15 mg/L higromisin, terakhir pada  medium dengan dosis higromisin lethal  minimum 25  mg/L.

Eksplan yang hidup pada medium  seleksi dipindahkan ke medium regenerasi yaitu medium ½ MS yang mengandung  vitamin B5, 30 g/L sukrosa dan 2 g/L gelrite. Untuk menginduksi pembentukan ES, ke  dalam medium ditambahkan kombinasi zat pengatur tumbuh 5 mg/L BAP dengan (0,00;  0,25 dan 0,50 mg/L) IAA. Pengamatan dilakukan terhadap persentase eksplan kalus yang membentuk ES dan rata-rata ES yang  terbentuk pereksplan kalus. Regenerasi planlet, ES yang sudah mencapai fase kotiledon dipindah ke medium ½ MS tanpa zat pengatur tumbuh. Pengamatan dilakukan terhadap persentase ES yang  berkecambah, planlet yang terbentuk, planlet yang berakar dan tinggi rata-rata planlet (Siswanto, et al. 2003).

1,1 kb

                 ←—→

        Hindl       Hindl

35S→

          ↓

                                 Sphl                                                                                       Nco

                          3hptll        ←      35S   →          Lac        →       35S gus      →         nos

                         ↓                                                                                                                   ↓

                         ↓         pCAMBIA1301     11837 bp                                                   ↓           L

                         ↓                                                                                                                   ↓          Sphl (2455

                           Kanamisin    →   OR    →   BOM    →      PVS      →        PVSI

Gambar 1.3 Peta plasmid pCAMBIA1301. RB (batas kanan) dan LB (batas kiri) T- DNA

Sumber: http://www.ipard.com/infopstk/publikasi/e-jurnal/biotek/MP71-02-02.pdf

Pengujian Ekspresi Gen GUS

Untuk mengetahui keberhasilan transformasi pada eksplan hasil kokultivasi dan eksplan yang tumbuh di medium seleksi,dilakukan uji ekspresi GUS berdasarkan  metode Jefferson et al. (1987). Eksplan yang  telah ditransformasi diinkubasi semalam dalam larutan X-Gluc (5 Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D glucoronide) pada suhu 37oC,  dicuci dalam etanol 99% dan disimpan pada  suhu 4oC, kemudian dilakukan pengamatan terhadap jumlah eksplan yang meng ekspresikan gen GUS di bawah mikroskop (Siswanto, et al. 2003).

Isolasi DNA dari Planlet Hasil Transformasi dan  Analisis Transgen

DNA genom diekstraksi dari planlet  menurut metode Castillo et al. (1994). Sebanyak 1 g daun digerus dalam nitrogen cair, dimasukkan  ke dalam tabung Eppendorf dan ditambah 75 µL buferekstrak, kemudian diinkubasi pada 65oC selama 15 menit. Campuran dibiarkan dingin  pada suhu kamar, kemudian diekstrak dengan larutan kloroform: isoamilalkohol (24:1). Setelah disentrifus 10 menit dengan kecepatan 13.000 rpm, pada suhu 4oC, supernatan dipindahkan ke dalam  tabung   Eppendorf yang berisi isopropanol, kemudian dicampur dengan cara membolak-balikkan tabung dan disentrifus selama 10 menit pada 8.000 rpm. Endapan DNA dicuci dengan  70% etanol  dan dikeringkan. Endapan DNA dilarutkan dalam 25 µL bufer TE untuk digunakan dalam analisis lebih lanjut (Siswanto, et al. 2003).

Integrasi   transgen dalam tanaman dianalisis dengan PCR menggunakan primer CHI. Reaksi PCR dengan template DNA dari daun  planlet transforman, menggunakan Gene  Amp PCR System 2400. Program PCR  terdiri dari inkubasi awal pada suhu 94oC selama 3 menit dilanjutkan dengan  35  siklus, yang masing-masing terdiri dari denaturasi 94oC 1 menit, penempelan  (annealing) 55oC 1 menit dan ekstensi 72oC selama 1 menit, dilanjutkan 3 menit untuk ekstensi akhir pada suhu 72oC. Produk PCR diverifikasi  dengan  elektroforesis pada  0,8 % gel agarosa. Hasil elektroforesis diamati dan didokumentasi di atas UV  transiluminator(Siswanto, et al. 2003).

Hasil dan Pembahasan

Optimasi medium seleksi

Salah satu tahapan penting yang harus dilalui dalam sistem transformasi untuk mendapatkan tanaman transgenik adalah seleksi. Tersedianya metoda seleksi sangat  diperlukan untuk menyeleksi  sel-sel transforman. Seleksi tahap awal yang biasa dilakukan adalah dengan menumbuhkan eksplan hasil transformasi pada medium  seleksi yang mengandung antibiotik tertentu  sesuai gen yang dibawa dalam vektor. Vektor pCAMBIA 1301 membawa gen penyandi  ketahanan  higromisin   dan kanamisin, sehingga seleksi sel-sel transforman dapat dilakukan menggunakan salah satu Antibiotic (Siswanto, et al. 2003).

Hasil pengujian efektivitas higromisin dalam menghambat pertumbuhan sel-sel kopi yang tidak membawa gen ketahanan  menunjukkan bahwa eksplan kalus yang  ditumbuhkan pada medium mengandung  higromisin mengalami kematian, diawali pada bagian yang bersentuhan langsung  dengan medium. Kematian kalus ditandai    dengan terjadinya pencokelatan, kemudian kalus mengering dan menghitam (Siswanto, et al. 2003).

Kematian kalus mulai terdeteksi pada minggu kedua pengamatan dengan persentase yang berbeda-beda. Semua kalus yang dikulturkan pada medium dengan 25 mg/L higromisin mati pada minggu ke empat. Pada medium 35 dan 45 mg/L higromisin kematian semua kalus terjadi lebih cepat yaitu pada minggu ketiga (Tabel 1). Hasil ini menunjukkan bahwa 25 mg/L adalah konsentrasi minimal higromisin yang diperlukan untuk menghambatmpertumbuhan dan merupakan konsentrasi lethal pada kalus kopi robusta klon BP308. Oleh karena itu, pada tahapan percobaan selanjutnya digunakan 25 mg/L higromisinm dalam medium seleksi (Siswanto, et al. 2003).

Transformasi dan Regenerasi Planlet Transforman

Pengaruh konsentrasi asetosiringon terhadap jumlah (persentase) kalus transforman, dinyatakan sebagai kalus yang tahan dalam medium seleksi dan berkembang menjadi embrio (Tabel 2). Tampak bahwa penambahan asetosiringon mampu meningkatkan persentase kalus tumbuh pada medium seleksi, yang berarti meningkatkan efisiensi transformasi. Persentase tertinggi kalus tumbuh (42,5 %) diperoleh pada konsentrasi asetosiringon 100 mg/L. Peningkatan konsentrasi asetosiringon lebih dari 100 mg/L tidak meningkatkan jumlah kalus yang tumbuh. Tanpa asetosiringon, transformasi masih dapat terjadi yang ditunjukkan dengan adanya kalus tumbuh pada medium tersebut, meskipun persentasenya rendah (23 %) (Tabel 2). Hal ini diduga karena tingginya kandungan fenolik pada tanaman kopi yang dikeluarkan pada saat pelukaan selama proses transformasi (Siswanto, et al. 2003).

Menurut James et al. (1993), penambahan asetosiringon ke dalam medium kokultivasi efektif meningkatkan efisiensi transformasi. Asetosiringon berperan meng-induksi gen VIR yang berfungsi dalam mentransfer T-DNA ke dalam sel tanaman dan meningkatkan efisiensi infeksi Agrobacterium (Orlikowska et al., 1995), sehingga dapat meningkatkan jumlah sel yang transforman. Namun asetosiringon tidak diperlukan apabila senyawa fenolik yang dikeluarkan oleh jaringan yang dilukai sudah cukup mengaktifkan gen VIR (Lopez et al., 2000). Leroy et al. (2000) berhasil memperoleh tanaman transgenic kopi tahan penyakit leaf minner dengan penambahan 10 mg/L asetosiringon.

Tabel 1. Jumlah dan persentase kalus mati pada beberapa konsentrasi higromisin

Konsentrasi higromisin Jumlah dan persentase eksplan mati (%)
Minggu
1 2 3 4 5 6
0 0/25 (0) 0/25 (0) 0/25 (0) 0/25 (0) 0/25 (0) 0/25 (0)
15 0/25 (0) 0/25 (0) 6/25 (24) 11/25 (44) 16/25 (64) 23/25 (92)
25 0/25 (0) 3/25(12) 19/25 (76) 25/25 (100) 25/25 (100) 0/25 (100)
35 0/25 (0) 17/25 (68) 25/25 (100) 25/25 (100) 25/25 (100) 0/25 (100)
45 0/25 (0) 21/25(84) 25/25 (100) 25/25 (100) 25/25 (100) 0/25 (100)

Keterangan: angka adalam kurung menunjukkan presentase eksplan mati

Sumber: http://www.ipard.com/infopstk/publikasi/e-jurnal/biotek/MP71-02-02.pdf

Sedangkan Sano & Kusano (2002) menggunakan 50 mg/L asetosiringon pada transformasi untuk mendapatkan tanaman kopi tahan herbisida. Perubahan eksplan kalus mulai terlihat setelah 2 minggu dalam medium seleksi yang mengandung 5 mg/L higromisin, yang ditunjukkan dengan mulai terjadinya pencokelatan pada beberapa kalus. Pemindahan kalus ke medium seleksi dengan konsentrasi higromisin lebih tinggi meningkatkan jumlah kalus yang mengalami pencokelatan dan kematian. Kalus mati merupakan kalus yang tidak tertransformasi, sehingga tidak mampu bertahan dalam medium mengandung higromisin. Sedangkan kalus tumbuh pada medium seleksi adalah kalus transforman. Kalus tersebut berwarna kuning remah, berstruktur embriogenik, dan berkembang membentuk planlet. Selama dalam medium seleksi, kalus juga mengalami proliferasi dan regenerasi, yang ditandai dengan semakin banyaknya jumlah kalus serta munculnya embrioid pada beberapa kalus. Persentase tertinggi embrioid pada medium seleksi yaitu 15,6% pada perlakuan

penambahan asetosiringon 50 mg/L. Kalus tumbuh pada medium seleksi yang mengandung 25 mg/L higromisin selanjutnya disubkultur  ke. medium regenerasi (R1, R2, R3 dan R4) selama 10 minggu untuk induksi dan regenerasi ES (Siswanto, et al. 2003).

Persentase kalus embrioid dan rata-rata embrio per kalus mengalami penurunan seiring dengan peningkatan konsentrasi IAA dalam medium, meskipun masih lebih tinggi dibandingkan dengan hasil pada medium tanpa zat pengatur tumbuh.

Kecendrungan ini terjadi baik pada kalus transforman maupun kalus kontrol. Hal ini menunjukkan bahwa penambahan BAP dan IAA mem-pengaruhi pembentukan ES dari kalus embriogenik dan jumlah ES yang dihasilkannya. Sitokinin berperan penting dalam induksi ES, sebaliknya auksin cenderung menghambat. Hatanaka et al. (1991) berhasil mendapatkan ES kopi robusta pada medium yang hanya mengandung sitokinin (Siswanto, et al. 2003).

Tabel 2. Jumlah eksplan kalus yang tahan terhadap tiga tingkat konsentrasi hidgomisin, dan kalus hasil seleksi yang mampu membetuk embrio

Konsentrasi asetosirogen Jumlah eksplan talus Jumlah eksplan kalus tahan higromisisn Klaus yang membentuk embrio
5 15 25
0 200 143 (71,5) 87 (40,5) 46 (23) 6 (13)
50 200 166 (83) 121 (60,5) 77 (38,5) 12 (15,6)
100 200 171 (85,5) 132 (66) 85 (42,5) 10 (11,8)
150 200 154 (77) 128 (64) 82 (41) 7 (8,5)

Sumber: http://www.ipard.com/infopstk/publikasi/e-jurnal/biotek/MP71-02-02.pdf

Untuk regenerasi planlet, ES yang telah mencapai fase kotiledon (Gambar 2D) dipindah ke medium tanpa zat pengatur tumbuh. Pada Tabel 4 terlihat pertumbuhan dan regenerasi ES hasil transformasi. Setelah 4 minggu, dari 197 ES fase kotiledon hasil transformasi, hanya 49,8% yang mampu berkecambah. Dari kecambah tersebut, 28,6% membentuk planlet normal (28 planlet) dan 85,7% dari planlet tersebut berakar. Rata-rata tinggi planlet transforman 8 bulan setelah transformasi adalah 14,7 ± 3,8 mm (Tabel 4). Dibandingkan dengan tanaman kontrol, planlet transforman menunjukkan pertumbuhan yang lebih lambat.

Table 3. Induksi dan regenerasi ES hasil transformasi pada beberapa medium regenerasi

Medium Jumlah kalus untuk induksi ES Jumlah kalus yang membentuk ES Rata-rata Es yang membentuk per kalus
Trans       kontrol Trans          Kontrol Trans        kontrol
0/0,00 72`                10 16,7              20 5,2±1,8      6,5±0,7
5/0,00 72                 10 43,1              70 8,8 ±3        11,6±2,8
5/0,25 73                 10 41,7              60 8,0±2,4       10,±2
5/0,50 73                 10 37,5              60  5,9±2,9      7,0±2,2

Hal ini diduga disebabkan oleh perlakuan transformasi dan insersi gen asing serta pengaruh antibiotik dalam medium menyebabkan tanaman mengalami cekaman sehingga menurunkan daya regenerasinya.

Tabel 4. Regenerasi planlet dari ES hasil transformasi pada medium tanpa zat pengatur tumbuh setelah 14 minggu di kulturkan

Perlakuan Embrio fase kotiledon Embrio berkecambah setelah 2 Minggu Planlet terbentuk setelah 14 minggu
Jumlah planlet terbentuk Planlet berakar Tinggi planlet rata-rata
Transformasi 197 98 (49,8) 28 (28,6) 24 (85,7) 14,71±3,75
Kontrol 25 17 (68) 11 (64,7) 11(100) 20,73±2,49

Keterangan: Angka dalam kurung menunjukkan persentase

Sumber: http://www.ipard.com/infopstk/publikasi/e-jurnal/biotek/MP71-02-02.pdf

Uji Ekspresi GUS

Uji histokimia ß-glukoronidase atau lebih dikenal dengan uji GUS dapat dilakukan pada tahap awal segera setelah kokultivasi (2-3 hari)  maupun setelah gen terintegrasi dengan stabil. Uji GUS pada penelitian ini dilakukan pada kalus 3 hari setelah kokultivasi, kalus yang tumbuh pada  medium seleksi, dan pada ES fase kotiledon yang terbentuk. Setelah direndam dengan larutan pewarna GUS, baik pada kalus setelah ko-kultivasi, kalus yang tumbuh pada medium seleksi, maupun pada embrio menunjukkan warna kebiruan yang menandakan adanya resipitasi hasil hidrolisa substrat X-gluc oleh enzim ß glukoronidase(Siswanto,et al. 2003).  Dengan terekspresinya gen GUS pada kalus dan embrio kopi robusta yang ditransformasi memberikan harapan bahwa gen penyandi kitinase telah terintegrasi, karena gen tersebut terdapat pada satu konstruksi T-DNA dalam plasmid vector yang sama ditransfer oleh Agrobacterium ke tanaman (Siswanto, et al. 2003).

Dari analisis PCR 12 planlet putative transgenik didapatkan 7 planlet yang terbukti mengandung sisipan gen kitinase yang ditunjukkan dengan adanya pita DNA berukuran sekitar 650 bp. Hal ini memperkuat bukti bahwa gen kitinase yang diintroduksikan berhasil tersisipi ke dalam genom tanaman kopi robusta klon BP308 (Siswanto, et al. 2003).

Tabel 5. Uji GUS dengan perlakuan asetositingon

Konsentrasi asetosiringon Persentasi eksplan positif GUS
3 hari setelah kultur Hasil seleksi
0 5/15 (33,3) 0/10 (0)
50 9/17 (52,9) 2/10 (20)
100 10/18 (55,6) 1/10 (10)
150 13/23 (56,5) 4/10 (40)

Keterangan: angka dalam kurung menunjukkan persentase

Sumber: http://www.ipard.com/infopstk/publikasi/e-jurnal/biotek/MP71-02-02.pdf

Surat An Nahl ayat 13

Artinya : Dan Dia (menundukkan pula) apa yang Dia ciptakan untuk kamu di bumi ini dengan berlain-lainan macamnya. Sesungguhnya pada yang demikian itu benar-benar terdapat tanda (kekuasaan Allah) bagi kaum yang mengambil pelajaran.

Maksud dari ayat di atas adalah Allah telah menciptakan berbagai macam makhluk hidup di bumi ini mulai dari yang bisa dilihat dengan mata sampai yang kasat mata. Itu merupakan tanda-tanda kekuasaan Allah. Misalnya saja bakteri Agrobagterium tumefaciens yang merupakan makhluk hidup mikroskopis yang diciptakan oleh Allah yang tidak hanya memberikan dampak negative yaitu menghasilkan racun bagi jamur tetapi juga memberikan dampak positif yaitu  kita dapat mempelajarinya dalam rekayasa genetika.

QS. Al-Furqan ayat 2:

 

 

 

Artinya: yang kepunyaan-Nya-lah kerajaan langit dan bumi, dan Dia tidak mempunyai anak, dan tidak ada sekutu bagiNya dalam kekuasaan(Nya), dan dia telah menciptakan segala sesuatu, dan Dia menetapkan ukuran-ukurannya dengan serapi-rapinya.

Maksud dari ayat diatas adalah segala sesuatu yang dijadikan Allah diberinya perlengkapan-perlengkapan dan persiapan-persiapan, sesuai dengan naluri, sifat-sifat dan fungsinya masing-masing dalam hidup. Dalam hal ini Allah telah menciptakan A. tumefaciens yang memiliki sebuah plasmid  Ti yang berisi gen penyandi faktor virulensi penyebab infeksi pada tanaman untuk keperluan perakitan tanaman transgenik.

Kesimpulan

1.  Agrobacterium tumefaciens adalah bakteri patogen pada tanaman yang banyak digunakan untuk memasukkan gen asing ke dalam sel tanaman untuk menghasilkan suatu tanaman transgenik.

2.  Penambahan asetosiringon ke dalam medium ko-kultivasi mempengaruhi jumlah kalus yang tumbuh pada medium seleksi dan persentase jumlah kalus yang meng-ekspresikan gen GUS Persentase tertinggi kalus yang tumbuh diperoleh pada medium seleksi yang mengandung 100 mg/L asetosiringon, sedangkan persentase ter-tinggi kalus yang mengekspresikan GUS baik pada kalus 3 hari setelah transformasi (56,5 %) maupun kalus yang tumbuh pada medium seleksi (40 %) diperoleh pada medium yang mengandung 150 mg/L asetosiringon.

3.  Dari penelitian ini telah berhasil diregenerasi 28 planlet kopi robusta putatif transgenik. Analisis PCR menunjukkan bahwa dari 12 planlet putative transgenik yang diuji, 7 planlet terbukti positif membawa gen kitinase.

Daftar Pustaka

Anonymous, 2011. Agrobacterium tumefaciens.http://id.wikipedia.org/wiki/Agrobacterium_tumefaciens diakses 4Januari 2012.

Anonymous, 2011. Tanaman Transgenik.http://id.wikipedia.org/wiki/Tanaman_transgenik diakses 4 Januari 2012.

Gamborg, O.L., R.A. Miller & K. Ojima (1968). Nutrient requirements of suspension culture of soybean root cells. Exp. Cell. Res., 50, 151-158.

Hatanaka, T., Y.E. Choi, T. Kusano & H. Sano (1999). Transgenic plants of coffee  from embryogenic callus via A. tumefaciens-mediated transformation. Plant Cell Rep.,19, 106-110.

Hiei, Y., T. Komari & T. Kubo (1997). Transformation of rice mediated by A. tumefaciens. Plant Mol. Biol., 35, 205-218.

James, D.J., S. Uratsu, J. Cheng, P. Negri, P. Viss & A.M. Dandekar(1993).Acetosyringone and osmoprotectants like betaine or proline synergistically enhance Agrobacterium-mediated trans-formation of apple. Plant Cell Rep.,12, 559-563.

Ren, Y. & C.A. West (1992). Elicitation of diterpene biosyntesis in rice (Oryza sativa L.) by chitin. Plant Physiol., 99,1169-1178.

Siswanto, et al. 2003. Transformasi kopi robusta dengan gen kitinase melalui A.tumefaciens LBA4404.http://www.ipard.com/infopstk/publikasi/e-jurnal/biotek/MP71-02-02.pdf diakses 4 Januari 2012.

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s

%d bloggers like this: