PEMANFAATAN MIKROORGANISME SEBAGAI INDIKATOR UJI

Pengujian mikrobiologi memanfaatkan mikroorganisme sebagai indikator pengujian. Dalam hal ini mikroorganisme digunakan sebagai penentu konsentrasi komponen tertentu pada campuran kompleks kimia, untuk mendiaknosis penyakit tertentu tertentu, serta untuk menguji bahan kimia guna menentukan potensi mutagenik atau karsinogenik suatu bahan. Macam-macam uji yang dapat dilakukan adalah uji antibiotik/antimikroba, bioautografi, uji vitamin dan asam amino, uji ames, dan penggunaan mikroorganisme sebagai model metabolisme obat mamalia.

Uji antibiotik antimikroba

Pada uji ini diukur respons pertumbuhan populasi mikroorganisme terhadap agen antimikroba. Tujuan assay antimikroba ( termasuk antibiotik dan substansi antimikroba nonantibiotik, misalnya fenol, bisfenol, aldehid), adalah untuk menentukan potensi dan kontrolkualitas selama prosesproduksi senyawa antimikroba dipabrik, untuk farmakokinetik obat pada hewan atau manusia dan untuk memonetor dan mengontrol kemoterapi obat. Kegunaan uji antimikroba adalah diperolehnya suatu sistem pengobatan  yang efektif dan efesien. Terdapat bermacam-macam metode uji antimikroba seperti yang dijelaskan berikut ini.

1. Metode difusi

  • Metode disc diffusion (tes Kirby dan Bauer) untuk menentukan aktivitas agen antimikroba. Piringan yang berisi agen antimikroba diletakkan pada media agar yang telah ditanami mikroorganisme yang akan berdifusi pada media agar tersebut. Area jernih mengindikasikan adanya hambatan pertumbuhan mikroorganisme oleh agen antimikroba permukaan media agar. (lihat gambar)

  • E-test

Metode E-test digunakan untuk mengestimasi MIC (minimum inhibitory concentration) atau KHM (kadar hambat minimum), yaitu konsentrasi minimal suatu agen antimikroba untuk dapat menghabat pertumbuhan mikroorganisme.

Pada metode ini digunakan strip plastik yang mengandung agen antimikroba dari kadar terendah hingga tertinggi dan diletakkan permukaan media agar yang telah ditanami mikroorganisme. Pengamatan dilakukan pada area jernih yang ditimbulkannya yang menunjukkan kadar agen antimikroba yang menghambat pertumbuhan mikroorganisme pada media agar.(lihat gambar)

  • Ditch-plate technique

Pada metode ini sampel uji berupa agen antimikroba yang diletakkan pada parit yang dibuat dengan cara memotong media agar dalam cawan petri pada bagian tengah secara membujur dan mikroba uji ( maksimum 6 macam ) digoreskan kearah parit yang berisi agen antimikroba.

  • Cup-plate technique

metode ini serupa dengan mitode disc diffusion, dimana dibuat sumur pada media agar yang telah ditanami dengan mikroorganisme dan pada sumur tersebut diberi agen antimikroba yang akan diuji.

  • Gradient-plate technique

Pada metode ini konsentrasi agen antimikroba pada media agar secara teoretis bervariasi dari 0 hingga maksimal. Media agar dicairkan dan larutan uji ditambahkan. Campuran kemudian dituang kedalam cawan petri dan diletakkan dalam posisi miring. Nutrisi kedua selanjutnya dihitung diatasnya.

Plate diinkubasi selama 24 jam untuk memungkinkan agen antimikroba berdifusi dan permukaan media mengering. Mikroba uji (maksimal 6 macam) digoreskan pada arah mulai dari konsentrasi tinggi ke rendah. Hasil diperhitungkan sebagai panjang total pertumbuhan mikroorganisme maksimum yang mungkin dibandingkan dengan panjang pertumbuhan hasil goresan.

Bila: X = panjang total pertumbuhan mikroorganisme yang mungkin

Y = panjang pertumbuhan aktual

C = konsentrasi final agen antimikroba pada total volume media mg/mL atau μ/mL,

Maka konsentrasi hambatan adalah: [(X.Y)]: C mg/mL atau μg/mL.

Yang perlu diperhatikan adalah dari hasil perbandingan yang didapat dari lingkungan padat dan cair faktor difusi agen antimikroba dapat mempengaruhi keseluruhan hasil pada media padat.

1. Metode dilusi

Metode dilusi dibedankan menjadi dua yaitu dilusi cair (broth dilution) dan dilusi padat (solit dilution).

  • Metode dilusi cair/broth dilution tes (serial dilution)

Metode ini mengukur MIC dan MBC (minimum inhibitory concentration atau kadar bunuh minimum,KBM). Cara yang dilakukan adalah dengan membuat seri pengenceran agen antimikroba pada medium cair yang ditambahkan dengan mikroba uji. Larutan uji agen antimikroba pada kadar terkecil yang terlihat jernih tanpa adanya pertumbuhan mikroba uji ditetapkan sebagai KHM tersebut selanjutnya dikultur ulang pada media cair tanpa penambahan mikroba uji ataupun agen antimikroba, dan diunkubasi selama 18-24 jam . media cair yang tetap terlihat jernih setelah inkubasi ditetapkan sebagai KBM.

  • Metode dilusi padat

Metode ini serupa dengan metode dilusi cair namun menggunakan media padat (solid). Keuntungan metode ini adalah satu konsentrasi agen antimikroba yang diuji dapat digunakan untuk menguji beberapa mikroba uji.

1. Uji aktivitas anti fungi

Pada uji ini kebutuhan media berbeda dengan uji menggunakan bakteri.media yang umum digunakan adalah Sabouroud Dextrose Liquid/solid, Czapex Dox, dan media khusus fungi lain. Uji ini serupa dengan uji untuk bakteri, dimana spora fungi atau miselium fungi dilarutkan pada larutan agen antimikroba uji, dan selanjudnya pada interval waktu tertentu disubkultur pada media yang sesuai. Setelah diinkubasi, pertumbuhan fungi pun diamati.

2. Uji aktivitas antivirus

Uji aktivitas antivirus menggunakan kultur jaringan maupun inokulasi telur berembrio. Campuran antara suspensi virus dan larutan agen antimikroba uji dibuat dalam seri pengenceran. Seri pengenceran ini dibuat pada serum yang telah diinaktivasi, misalnya serum kuda, dan diinokulasikan pada kultur sel atau telur berembrio. Sebagai kontrol digunakan larutan tanpa virus. Karena obat juga dapat tosik pada kultur jaringan atau telur, maka toksisitasnya harus diuji. Seri pengenceran Obat dicampurkan dengan serum yang dinaktivasi dan dinokulasi ke dalam sel jaringan atau telur berembrio. Pengamatan dilakukan setiap hari  terhadp ada atau tidaknya kerusakan sel atau jaringan.

Selain menggunakan kultur sel atau telur, uji aktivitas antivirus juga dapat dilakukan pada hewan percobaan, contohnya pada pengujian virus hepatitis B (HBV) yang tidak dapat ditumbuhkan pada kultur sel ataupun telurberembrio.

Uji bioautografi

Uji bioautografi merupakan metode spesifik untuk mendeteksi bercak pada kromatogram hasil KLT ( kromatografi lapis tipis ) yang memiliki aktifitas antibakteri, antifungi dan antivirus, sehingga mendekatkan metode separasi dengan uji biologis.

Keuntungan metode ini adalah sifatnya yang efesien untuk mendeteksi adanya senyawa antimikroba karna letak bercak dapat ditentukan walaupun berada dalam campuran yang kompleks sehingga memungkinkan untuk mengisolasi senyaw aktif tersebut. Kerugiannya adalah metode ini tidak dapat digunakan untuk menetukan KHM dan KBM. Ada dua macam metode bioautografi, yaitu:

  • Bioautografi langsung : Dengan menyemprot plat KLTdengan suspensi mikroorganisme ataupun dengan menyentuhkan plat KLT pada mermukaan media agar yang telah ditanami mikroorganisme. Setelah inkubasi pada waktu tertentu, letak senyawa aktif tampak sebagai area jernih dengan latar belakang keruh.
  • Bioautografi overlay: dengan menuangkan media agar yang telah dicampur dengan mikrioorganisme diatas permukaan plat KLT, media ditunggu hingga padat, kemudian diinkubasi. Area hambatan dilihat dengan penyemprotan menggunakan tetrazolium klorida. Senyawa yang aktif sebagai antimikroba akan tampak sebagai area jernih dengan latar belakang ungu.

Uji vitamin dan asam amino

Uji ini merupakan kebalikan dari uji antimikroba ( uji antibiotik ) yang didasarkan pada penghambatan pertumbuhan mikroorganisme. Assay vitamin dan asm amino justru didasarkan pada peningkatan pertumbuhan mikroorganisme. Pada uji ini diperlukan media kultur bernutrisi yang sesuai untuk mikroba uji, yaitu memiliki semua faktor pertumbuhan kecuali faktor yang akan diujikan. Kurva kalibrasi dari konsentrasi substansi uji terhadap beberapa parameter pertumbuhan mikroorganisme seperti berat sel kering ( BSK ) dapat diplotkan sehingga konsentrasi faktor pertumbuhan dapat ditentukan. Contoh uji ini yaitu:

  • Assay biotin, asam folat dan riboflavin oleh lactobasillus casei
  • Assay kalsium patotenat, dan asam nikotinat oleh lactobasillus arabinosus
  • Assay sianokobalamin oleh lactobasillus leichmanii
  • Assay inositol oleh saccharomyces uvarum
  • Assay tiamin oleh lactobasillus viridans

Uji Ames

Uji Ames (Ames test) merupakan uji untuk mengidentifikasi bahan kimia yang bersifat mutagenik atau karsinogenik dengan menggunakan bakteri sebagai indikator kasinogenik. Uji ini didasarkan pada pengamatanbahwa paparan bakteri mutan terhadap substansi mutagenikdapat menyebabkan mutasi baru yang meniadakan efek mutasi asli berupa perubahan fenotipe, disebut back mutation atau reversion.

Secara spesifik, uji Ames menguji Salmonella auksotrof histidin (sel-his) yaitu mutan Salmonella yang kehilangan kemampuan untuk mensintesis histidin, menjadi sel his+ setelah perlakuan dengan bahan mutagenik.

Bahan kimia harus diaktivasi ( diubah secara kimia kedalam bentuk kimia yang relatif ) dengan menggunakan enzim hewani agar aktivitas atau karsinogenik dapat muncul. Bahan kimia uji dan bakteri mutan diinkubasi bersama-sama dengan ekstrak hati tikus yang kaya enzim aktivasi. Bila bahan kimia yang diuji bersifat mutagenik, akan terbentuk reversi bakteri his- menjadi his+ . jumlah revertant yang terbentuk mengindikasikan derajat mutagenik atau karsinogenikbahan kimia yang diuji

Penyempurnaan lebih lanjut terhadap uji Ames memungkin penyaringan bahan-bahan yang memerlukan aktivitas metabolik sebelum motagenitas bahan-bahan itu tampak. Hal ini bisa dilakukan dengan menggabungkan pada lapisan agar bagian atas, bersama dengan bakteri tersebut, homogenat hati tikus ( atau manusia ) yang sistem enzim pengaktivasinya telah dimunculkan dengan pengeksposan pada campuran bifenil yang telah mengalami poliklorinasi. Uji ini kadang-kadang disebut pengukuran Salmonella atau mikrosom karna menggunakan fraksi-fraksi homogenat hati yang disebut fraksi S9dan mengandung banyak mikrosom hati.

Penting disadari bahwa uji ini bersifat fleksibek dan dan masih mengalami modifikasi dan pengembangan. Hampir semua karsinogen manusia yang telah diketahui telah diuji dan menunjukkan hasil positf. Karsinogen tersebut meliputi bahan-bahan seperti β-naftilamin, kondensat asap rokok aflatoksin B, dan vinil klorida, dan juga obat-obatan yang digunakan pada pengobatan kanker seperti adriamisin, daunomisin dan mitomisin C.

Penggunaan mikroorganisme sebagai model metabolisme obat mamalia

Keamanan dan kemanjuran obat harus dievaluasi secara luas sebelum digunakan untuk mengobati penyakit pada manusia. Penelitian terhadap cara obat dimetabolisasi sangat bermanfaat karena penelitian semacam ini menyediakan informasi tentang cara aksi obat, mengapa obat menunjukkan toksisitas, serta bagaimana obat didistribusikan, diekskresikan, dan disimpan didalam tubuh. Secara tradisonal, penelitian metabolisme obat menggunakan model binatang, dan sampai pada batas tertentu, menggunakan preparasi mikrosomal hati, kultur jaringan dan sistem organ tertentu. Masing-masing model ini memiliki kekurangan dan kelebihan tertentu dan terdapat tekanan cukup besar dari kelompok-kelompok pemerhati binatang untuk menghentikan penggunaan binatang pada penelitian ilmiah.

Penggunaan sistem mikrobial sebagai model  in vitro untuk metabolisme obat pada manusia disebabkan oleh adanya banyak kesamaan diantara sistem enzim mikrobial tertentu dan sistem enzim hati mamalia. Kelebihan utama penggunaan mikroorganisme adalah kemampuannya untuk menghasilkan jumlah metabolit yang signifikan, sebaliknya hal tersebut sulit diperoleh dari sistem binatang atau sintesis kimiawi. Selain itu, penggunaan mikroorganisme dapat mengurangi biaya operasional penelitian bianatang.

Penelitian metabolisme obat mikrobial biasanya diawali menapis (skrining) sejumlah besar mikroorganisme untuk mengetahui kemampuannya dalam mitabolisme suatu substrat obat. Sebagai substrat biasnya ditumbuhkan pada media seperti glukosa pepton pada tabung labu yang digoyang-goyang untuk memberikan aerasi yang baik. Obat sebagai substrat biasanya ditambahkan setelah pertumbuhan 24 jam, kemudian diambil sebagai sampel untuk mengetahui adanya metabolit dengan interval tertentu sampai 14 hari setelah penambahan substrat. Tidak lama lagi setelah ditentukan bahwa suatu mikroorganisme memetabolisme obat, proses secara keseluruhan dapat diperbesar sklalanya  untuk prduksi sejumlah besar metabolit menentukan struktur dan sifat-sifat biologisnya.

Misalnya, metabilisme obat antidepresan imipramin. Didalam sistem mamalia, imiparamin dimetabolisme menjadi lima metabolit utama, yaitu 2-hydroxymipramine, 10- hydroxymipramine, iminodibenzil, imipramine-N-oxide, dan desipramin. Untuk penelitian metabolisme mikrobial, sejumlah besar fungi ditapis, dan beberapa diantaranya dipilih untuk produksi skala preparatif metabolit imipramin. Cunninghamella blacesleeana menghasilkan metabolit terhidroksilasi berupa 2- hydroxymipramine dan 10- hydroxymipramine; Aspergillus flavipes menghasilkan turunan N-oxide, sedangkan fusarium oxysporum f.sp cepae menghasikan iminodibenzil; sementara secara farmakologis metabolit aktif desipramin dan 10-hydroxy dan metabolit N-oxide dihasilkan oleh mucor griseocyanus. Meningkatkan skala prosedur ini, jumlah signifikan metabolit yang sama dengan yang terbentuk dalam metabolisme mamalia dapat diperoleh.

Oleh karena itu, mikroorganisme memiliki potensi yang cukup besar sebagai alat untuk meneliti mikroorganisme obat. Meskipun mikroorganisme tidak dapat sepenuhnya  menggantikan binatang, mikroorganisme sangat bermanfaat sebagai model prediktif penelitian awal.

DAFTAR PUSTAKA

T.pratiwi, Sylvia. 2008. Mikrobiologi farmasi. Erlangga : jogya katarta

Atlas, R.M., Brown, A.E., Debra, K.W., dan Lionas, M.,1989, Ekperimental Mikrobiology fundamental and Application, MacMillan publishing company, New York.

Betina, V., 1983, The chemistry and Biology of Antibiotics, Scientific Publishing Company, New York.

Batrowne, L.M., dan Szenthe, N.A., 1989, Labory Manual for Mikrobilogy, Departement of Chemistry, Uiversity of Alberta, Canada.

http://www.helios.bto.ed.ac.uk/bto/microbes/bt.html, deacon, J.,2002, The mikrobial world: bacillus thuringiensis.

http://www.molbio.princeton.edu./courses/mb427/2001/projecst/02/antibiotics.html,Antibiotics

http://www.bmb.leeds.ac.uk/mbiology/ug/ugteach/dental/tutorials/introduction/fungi.html, medical mikrobiology: a brief introduction

http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/biologypages/A/Antibiotics.html,Abstract Antibacteria.

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s

%d bloggers like this: