REKAYASA GENETIKA MIKROORGANISME PENGHASIL ENZIM LIPASE UNTUK PRODUK BAKERY

1.1 Enzim Lipase

Enzim lipase merupakan salah satu enzim yang memiliki sisi aktif sehingga dapat menghidrolisis triasilgliserol menjadi asam lemak dan gliserol. Enzim lipase dapat digunakan untuk menghasilkan emulsifier, surfaktant, mentega, coklat tiruan, protease untuk membantu pengempukan daging, mencegah kekeruhan bir, naringinase untuk menghilangkan rasa pahit pada juice jeruk, glukosa oksidase untuk mencegah reaksi pencoklatan pada produk tepung telur dan lain-lain.

 

Sumber-sumber enzim lipase antara lain : bakteri (S. aureus), kapang (Aspergillus niger, Rhizopus arrhizus), tanaman yang menghasilkan trigliserida (kacang-kacangan), pancreas, susu.

Faktor-faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim lipase:

  • Suhu; Suhu optimal lipase adalah 30-400C, aktivitas akan berkurang pada suhu dibawah 30 0C dan diatas 40 0C.
  • pH; Lipase memiliki pH optimal 8-9, beberapa golongan dapat bekerja pada pH 4,1-6,3
  • Konsentrasi substrat; Jika konsentrasi substrat rendah maka semua substrat akan berikatan dengan enzim. Jika konsentrasi substrat naik maka akan lebih banyak enzim yang berikatan dengan substrat. Semakin tinggi konsentrasi substrat tidak akan meningkatkan kecepatan reaksi.
  • Konsentrasi enzim; Kecepatan aktivitas enzim berbanding lurus dengan konsentrasi enzim.
  • Adanya aktivator; Beberapa ion dan molekul mempunyai kemampuan menonaktifkan enzim.
  • Spesifisitas substrat; Lipase akan bekerja degan baik jika enzim menemukan substrat yang sesuai dengan karakteristik dan kemampuannya.
  • Pelarut organik; Pelarut organik digunakan untuk melarutkan lemak agar pada suhu kamar ada pada keadaan cair. Dalam menggunakan pelrut organik yang harus diperhatikan adalah jenis pelarutnya dan volume nya.

 

Aplikasi enzim lipase untuk sintesis senyawa organik semakin banyak dikembangkan, terutama karena reaksi menggunakan enzim lipase bersifat regioselektif dan enansioselektif. Aktifitas katalitik dan selektivitas enzim, tergantung dari struktur substrat, kondisi reaksi, jenis pelarut, dan penggunaan air dalam media.Contohnya biosintesis senyawa pentanol, hexanol & benzyl alkohol ester, serta biosintesis senyawa terpene ester menggunakan enzim lipase yang berasal dari Candida antartica dan Mucor miehei.

 

 

 

1.2 Isolasi Enzim Lipase Dari Mikroorganisme

Lipase merupakan biokatalis yang secara umum diperlukan untuk hidrolisis lemak, mono- dan di-gliserida yang akan menghasilkan asam lemak bebas dan gliserol dan sebaliknya pada kondisi tertentu lipase juga mengkatalisis reaksi sintesis gliserida dari gliserol dan asam lemak. Aplikasinya dapat dijumpai antara lain pada industri makanan dan minuman, deterjen, farmasi, agrokimia, dan oleokimia.

Penggunaan lipase dalam industri makanan memiliki keunggulan karena hidrolisis yang dikatalisis bersifat spesifik. Modifikasi oleh enzim lipase yang memiliki spesifisitas reaksi 1,3-gliserida menghasilkan gliserida dengan produk utama diasilgliserol (DAG) dan produk samping monoasilgliserol (MAG) serta asam lemak bebas dan gliserol. Minyak kaya DAG dapat berfungsi sebagai minyak sehat karena antara lain dapat mengurangi trigliserida (TG) dalam serum darah, mencegah akumulasi lemak dalam tubuh dan memperbaiki rasio kolesterol serum darah.

Rekayasa genetika untuk memproduksi senyawa bernilai ekonomi tinggi telah banyak dikembangkan, terutama dalam industri makanan dan farmasi. Pendekatan produksi lipase yang umum dilakukan dan telah berkembang ke tingkat komesialisasi adalah eksplorasi dan skrining strain kapang secara intensif yang diikuti dengan rekayasa genetika. Salah satu contoh adalah Lipolase. Lipase rekombinan yang diproduksi oleh Novo Nordisk ini, menggunakan gen lipase yang berasal dari Humicola yang kemudian diekspresikan di dalam sel inang baru yaitu Aspergillus oryzae. Eksplorasi dan skrining kapang yang berpotensi tinggi sebagai penghasil lipase merupakan tahapan penting dalam rekayasa genetika produksi lipase. Beberapa kapang diketahui mampu menghasilkan lipase yaitu Aspergillus niger, Mucor miehei, Monilia sitophila, Rhizopus delemar dan R. Javanicus.

Lipase yang berasal dari mikroba umumnya bersifat ekstraseluler. Isolasi gen yang menyandi protein lipase merupakan salah satu langkah awal produksi lipase dalam skala besar melalui rekayasa genetika. Mengemukakan bahwa Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan metode deteksi yang tergolong mudah untuk mengetahui keberadaan gen target di dalam organisme uji. Pasangan primer heterologous yang dirancang berdasarkan daerah terkonservasi pada gen target dapat digunakan dalam PCR tersebut.

Lipase merupakan enzim yang memiliki karakter spesifik tergantung organisme penghasilnya. Beberapa lipase yang dihasilkan organisme-organisme dalam satu genus juga memiliki karakter berbeda meskipun secara umum memiliki motif asam amino yang sama untuk tiap organisme. Motif asam amino ini berupa urutan asam amino Glisin-X-Serin-X-Glisin (G-X-S-XG) yang juga merupakan sisi aktif dari enzim ini, dimana X dapat digantikan oleh Histidin, Leusin, atau Tirosin (Salomon, 2003). Pengaruh lingkungan kemungkinan turut memberikan peranan terhadap organisme penghasil lipase.

1.3 Isolasi RNA kapang

Isolasi RNA kapang menunjukkan kualitas dan kuantitas RNA hasil diisolasi dari ketiga jenis kapang penghasil lipase yang potensial yaitu R. oligosporus, A. corymbifera dan R. oryzae. Kunci keberhasilan untuk mendapatkan RNA kapang dengan kuantitas yang tinggi adalah umur pertumbuhan yang sekaligus menentukan jumlah miselium yang dipanen. Kapang yang dipanen untuk isolasi RNA umumnya mengandung sekitar 6 x 108 sel atau ekivalen dengan 1– 1,5 gram biomassa miselium, yang menunjukkan bahwa metabolisme kapang sedang berada pada laju eksponensial. Kapang dengan dinding sel yang 80% terdiri dari polisakarida lebih mudah mengalami lisis sehingga jumlah RNA yang diperoleh sangat tinggi. RNA kapang yang diperoleh selanjutnya digunakan untuk sintesis cDNA.

Miselium kapang dipanen menggunakan ose steril dan dicuci dengan akuades steril,kemudian digerus dalam mortar dengan menambahkan nitrogen cair hingga berbentuk serbuk beku. Ke dalam 2,5 g serbuk miselium beku ditambahkan 10 Ml bufer ekstraksi (Trizma Base 0,2 M, LiCl 0,3 M, EDTA 0,01 M, PVP MW 36,000 1%, tiourea 5 mM, aurintrikarboksilat 1 mM, dan 2-Merkaptoetanol 2%). Campuran dikocok kuat, ditambahkan 1 volume campuran fenol:kloroform: isoamilalkohol (25:24:1), divorteks 3×30 detik, kemudian disentrifus pada kecepatan 15.000 rpm, suhu 4°C selama 15 menit. Supernatan diekstraksi sekali lagi menggunakan kloroform : isoamilalkohol (24:1) sebanyak 1 volume dilanjutkan dengan sentrifus kembali pada kecepatan, suhu dan waktu yang sama. Supernatan dipindahkan ke dalam tabung sentrifus baru, kemudian ditambahkan 1/30 volume Na asetat 3,3 M pH 5,2 dan 1/10 volume etanol absolut. Setelah campuran diinkubasi dalam es selama 30 menit, RNA diendapkan melalui sentrifugasi (15.000 rpm, 4°C, 25 menit). Endapan RNA dicuci menggunakan etanol 70% dingin dilanjutkan dengan sentrifugasi (8000 rpm, 4°C, 25 menit). Endapan RNA dilarutkan dengan DEPCdH2O. RNA dipisahkan dari DNA dengan menambahkan LiCl 8 M ke dalam larutan RNA hingga konsentrasi akhir 2 M. Campuran didiamkan selama 4-16 jam pada suhu 4°C, kemudian disentrifus 13.000 rpm, 4°C, 20 menit). Endapan RNA dibilas menggunakan etanol dingin 70%, dilanjutkan dengan sentrifugasi (5000 rpm, 4°C, 5 menit). Endapan RNA dilarutkan menggunakan 50-100μL DEPC-dH2O. RNA yang diperoleh diuji kualitas dan kuantitasnya menggunakan elektroforesis pada gel agarosa 0,8% dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 260 dan 280 nm

Gambar diatas menunjukkan kualitas dan kuantitas RNA hasil diisolasi dari ketiga jenis kapang penghasil lipase yang potensial yaitu R. oligosporus, A. corymbifera dan R. oryzae. Selain konsentrasinya yang cukup tinggi, Nampak bahwa RNA yang dihasilkan dari ketiga kapang juga memiliki tingkat kemurnian tinggi yang ditunjukkan dengan rasio A260/280 dan A260/230 ³ 1.800 dan secara visual ditunjukkan oleh dua pita ribosomal RNA yaitu 28S dan 18S yang jelas. Kunci keberhasilan untuk mendapatkan RNA kapang dengan kuantitas yang tinggi adalah umur pertumbuhan yang sekaligus menentukan jumlah miselium yang dipanen. Kapang yang dipanen untuk isolasi RNA umumnya mengandung sekitar 6 x 108 sel atau ekivalen dengan 1– 1,5 gram biomassa miselium, yang menunjukkan bahwa metabolisme kapang sedang berada pada laju eksponensial. Kapang dengan dinding sel yang 80% terdiri dari polisakarida lebih mudah mengalami lisis sehingga jumlah RNA yang diperoleh sangat tinggi. RNA kapang yang diperoleh selanjutnya digunakan untuk sintesis cDNA.

 

 

 

1.4 Amplifikasi fragmen gen Lipase

Untuk mengetahui secara pasti panjang dan susunan nukleotida fragmen produk RTPCR tersebut, dilakukan isolasi dan pemurnian fragmen dari gel, kloning dan isolasi plasmid rekombinan, dilanjutkan dengan sekuensing. Prinsip kerja program ini adalah membandingkan pixel gambar masingmasing sampel dengan menggunakan marka DNA sebagai standar konsentrasi. Baik secara visual maupun secara kuantitatif nampak hasil RT-PCR tertinggi. Semakin tinggi spesifisitas primer, maka semakin tinggi produk RT-PCR yang Dihasilkan. Produksi lipase oleh kapang pada umumnya dipengaruhi kondisi lingkunganmenghasilkan lipase ekstraseluler sebagai biokatalis untuk mencerna lemak. Dipilih untuk kloning ke dalam E. Coli dilanjutkan dengan analisis DNA untuk mengkonfirmasi kebenaran produk RTPCR sebagai fragmen gen LIPASE.

Hasil amplifikasi fragmen gen LIPASE dari ketiga kapang ditunjukkan pada Gambar diatas nampak bahwa ketiganya menghasilkan fragmen DNA berukuran sedikit lebih rendah dari 500 bp. Untuk mengetahui secara pasti panjang dan susunan nukleotida fragmen produk RTPCR tersebut, dilakukan isolasi dan pemurnian fragmen dari gel, kloning dan isolasi plasmid rekombinan, dilanjutkan dengan sekuensing. Kuantifikasi hasil amplifikasi tersebut dengan program UNSCAN- IT Gel 6.1. Prinsip kerja program ini adalah membandingkan pixel gambar masing – masing sampel dengan menggunakan marka DNA sebagai standar konsentrasi.

Perbedaan kuantitas hasil RT-PCR tersebut dapat mencerminkan perbedaan tingkat ekspresi gen LIPASE dari ketiga kapang yang dianalisis. A. corymbifera paling kuat mengekspresikan LIPASE dibanding dua kapang lainnya. Apabila hal ini benar, maka A. corymbifera merupakan kandidat yang baik untuk produksi lipase, baik langsung maupun dengan rekayasa genetika. Namun perbedaan kuantitas hasil RT-PCR juga dapat disebabkan oleh perbedaan spesifisitas primer terhadap sekuen gen LIPASE dari ketiga kapang. Semakin tinggi spesifisitas primer, maka semakin tinggi produk RT-PCR yang dihasilkan. Ekstrasi dan analisis aktivitas lipase dari ketiga kapang akan mengkonfirmasi apakah kuantitas produk RT-PCR disebabkan oleh perbedaan tingkat ekspresi atau karena perbedaan spesifisitas primer. Produksi lipase oleh kapang pada umumnya dipengaruhi kondisi lingkungan Minyak sawit yang terkandung dalam medium menginduksi kapang untuk menghasilkan lipase ekstraseluler sebagai biokatalis untuk mencerna lemak. Perakitan sel rekombinan memerlukan enzim lipase dengan sekresi tinggi, sehingga perbedaan kuantitas cDNA yang dihasilkan oleh ketiga jenis kapang melalui RT-PCR dalam penelitian ini merupakan informasi berharga, terutama apabila teknik yang sama akan digunakan dalam isolasi gen lengkapnya untuk rekayasa genetika. Karena kuantitasnya yang tinggi, maka fragmen produk RTPCR dari A. corymbifera (Ac_LIP4) dipilih untuk kloning ke dalam E. coli dilanjutkan dengan analisis DNA untuk mengkonfirmasi kebenaran produk RTPCR sebagai fragmen gen LIPASE.

 

1.5 Isolasi dan analisis fragmen DNA Ac_LIP4 hasil RT-PCR

Koloni putih hasil transformasi E. Coli XL1Blue menggunakan fragmen DNA produk RT-PCR asal A. Corymbifera (Ac_LIP4) dianalisis untuk memastikan ada tidaknya sisipan fragmen DNA produk RT-PCR terklon, dengan teknik PCR koloni menggunakan primer LIP4F/R. Isolasi plasmid kemudian dilakukan untuk mendapatkan plasmid yang telah tersisipi fragmen Ac_LIP4. Sekuensing DNA yang dilanjutkan dengan analisis BLAST VecScreen untuk menghilangkan kontaminasi sekuen DNA yang berasal dari vektornya. Dengan demikian dapat dipastikan bahwa fragmen tersebut adalah fragmen gen LIPASE.

Koloni putih hasil transformasi E. coli XL1Blue menggunakan fragmen DNA produk RT-PCR asal A. corymbifera (Ac_LIP4) dianalisis untuk memastikan ada tidaknya sisipan fragmen DNA produk RT-PCR terklon, dengan teknik PCR koloni menggunakan primer LIP4F/R (Gambar 3). Dari 12 koloni yang dianalisis, lima koloni menunjukkan hasil positif, yang ditunjukkan oleh adanya sisipan DNA berukuran sekitar 462 pb.

Isolasi plasmid kemudian dilakukan untuk mendapatkan plasmid yang telah tersisipi fragmen Ac_LIP4. Gambar 4 memperlihatkan plasmid hasil isolasi dari E. coli rekombinan. Digesti plasmid membuktikan kembali keberadaan DNA sisipan pada plasmad rekombinan (Gambar 4 lajur 2). Sekuensing DNA yang dilanjutkan dengan analisis BLAST VecScreen untuk menghilangkan kontaminasi sekuen DNA yang berasal dari vektornya, menghasilkan sekuen DNA sepanjang 462 bp (Gambar 5). Hasil analisis BLASTn secara jelas menunjukkan skor yang tinggi (435 – 773) dan E value yang sangat rendah (6e-119 sampai 0.0) antara fragmen Ac_LIP4 produk RT-PCR terklon dengan gen LIPASE dari R. oryzae, R. niveus, R. delemar, R. microsporus dan R. Stolonifer (Tabel 3). Dengan demikian dapat dipastikan bahwa fragmen tersebut adalah fragmen gen LIPASE.

 

1.6 APLIKASI ENZIM LIPASE DALAM INDUSTRI BAKERY

Dalam bidang pangan, nutrisi dan nilai sensoris serta sifat fisik dari lemak dan minyak banyak dipengaruhi oleh beberapa faktor, seperti posisi asam lemak dalam rantai gliserol, Panjang rantai asam lemak, dan derajat tidak jenuh (degree unsaturation). Lipase memungkinkan modifikasi dari sifat lemak dengan mengubah lokasi dari rantai asam lemak pada gliserida dan mengganti satu atau lebih asam lemak dengan satu asam lemak yang baru. Lipase digunakan untuk meningkatkan atau mengembangkan flavouring agent pada produk bakery.

Lipase juga digunakan sebagai pengganti dari emulsifier dan untuk memperbaiki rheologi adonan untuk memproduksi remah-remah dan tekstur yang lebih lembut pada roti. Beberapa lipase digunakan pada cakes untuk mengganti emulsifier atau memperkuat adonan untuk memproduksi cake yang berangin dengan tekstur yang lembut, yang disebut Fatula. Lipase juga bekerja untuk membebaskan beberapa lemak pada tepung yang diikat oleh protein. Dengan melepaskan lemak-lemak tersebut dan memecahnya dari ikatannya, lemak-lemat tersebut bebas untuk digunakan pada roti dengan baik. Enzim lipase memodifikasi lemak alami dari tepung, jadi lipase dapat berfungsi sebagai emulsifier dan mengurangi penambahan emuilsifier tanpa mengurangi kualitas produk bakery.

 

 

 

 

 

 

DAFTAR PUSTAKA

 

Nining, A. 2005. Isolasi dan penapisan mikroba penghasil lipase spesifik – gliserida serta penentuan kondisi optimum produksi diasilgliserol menggunakan minyak sawit mentah. Jakarta, Universitas Indonesia. Tesis. 60 p.

 

Pradana, R. 2007. Nyiur Melambai, Nusantara. Mediacare. Diunduh dari       http://www.mailarchive.com/mediacare@ yahoogroups.com/msg25408.html.

 

Putranto, R.A., D. Santoso, Tri-Panji, Suharyanto & A. Budiani. 2006. Karakterisasi gen      penyandi Lipase dari kapang R. oryzae dan A. corymbifera. Menara Perkebunan, 74(1), 1-5.

 

Putranto, Riza A. & A. Budiani. 2009. isolasi fragmen gen lipase dari kapang absidia corymbifera,rhizopus oryzae dan rhizopus oligosporus. Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, Bogor 16151, Indonesia

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s

%d bloggers like this: